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貨號(hào)：LE-1-341

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

ME 廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高 。ME 催化蘋(píng)果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和 CO₂ ，以及伴隨 NAD(P)⁺ 的還原反應(yīng)，是蘋(píng)果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME 活性與 生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來(lái)植物 ME  活性測(cè)定較多， 已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專(zhuān)一性和對(duì)底物特異性的不同，可將 ME 分為 NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測(cè)定原理：

NADP-ME 催化 NADP⁺ 還原成 NADPH ，在 340nm 下測(cè)定 NADPH 增加速率。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存。；

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶 ，-20℃保存；  臨用前加入 50mL 試劑一充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入 6mL 蒸餾水充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20 度保存，禁止反復(fù)凍融。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液  體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰  浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 14000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。 14000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 850μL 試劑二 ，混勻 ，30℃孵育 5min，加入 100μL 試劑三， 混勻后立即記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

NADP-ME 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmo/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmo/min/g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=3215×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmo/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=6.43×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T：反應(yīng)時(shí)間， 1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì) 濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。