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6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-337

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

G6PDH（EC 1.1.1.49）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，催化 6-磷酸葡萄糖氧化為 6 -磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時將 NADP⁺ 還原為 NADPH，供 生物合成及維持細(xì)胞內(nèi)的還原狀態(tài)用。 因此 6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性的高低可以從一定程 度上反映出生物體的生物合成和抗氧化能力。

測定原理：

G6PDH 催化 NADP⁺ 還原生成 NADPH，在 340 nm下測定 NADPH 增加速率。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 47.5 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 1000~5000： 1 的比例（建議 2000 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解；在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種） 水浴 10min 以上； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 950μL 試劑一，混勻后立即記錄 340nm 處 1min 后吸光值 A1 和 6min 后的吸光值 A2 ，計算 ΔA=A2-A1。

注意：若 ΔA 大于 0.5 ，需將酶液用提取液稀釋，計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)?；?qū)⒎磻?yīng)時間縮短至 2min，使 A2-A1 小于 0.5 ，可提高檢測靈敏度。

G6PDH 活力單位的計算：

1、血清（漿）G6PDH 活力的計算:

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。 

G6PDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=643×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6PDH 活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=643×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×110⁹]÷(2000×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.3215×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1×10^-3 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時間，5  min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞 總數(shù)，2000 萬。