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查爾酮異構(gòu)酶( CHI) 試劑盒說明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-189

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase, CHI)是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的黃酮類化合物合成相關(guān)酶，也是黃 酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。查爾酮異構(gòu)酶和查爾酮合酶一起構(gòu)成了黃酮類化合物生物合成 的限速酶。

測(cè)定原理：

查爾酮異構(gòu)酶（CHI）催化查爾酮環(huán)化形成 4,5,7-三羥基黃烷酮，通過測(cè)定 381nm 下的吸光 度變化表示 CHI 的活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研缽、冰和蒸 餾水

試劑的組成：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存； 用時(shí)加入 50mL 試劑一充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保 存。

粗酶液提?。?/span>

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 381nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定表

在 1mL 玻璃比色皿中加入 50μL 上清和 950μL 試劑二，立即混勻并記錄 381nm下初始吸光 值 A1 和 37℃保溫 30min 后的吸光值 A2。計(jì)算 ΔA ＝A2-A1。

CHI 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每小時(shí) A381 變化 0.1 為一個(gè)酶活力單位。 

CHI（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.1÷T

=400×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每小時(shí) A381 變化 0.1 為一個(gè)酶活力單位。 

CHI（U/g  鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.1÷T

=400×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1mL； V 樣：加入樣本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體 積， 1 mL； T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。