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脲酶 測(cè)定試劑盒說明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-310

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

UE 能夠水解尿素，產(chǎn)生氨和碳酸。UE 活性與有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān)， 反應(yīng)了氮素狀況。

測(cè)定原理：

利用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定脲酶水解尿素產(chǎn)生的 NH3-N。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1瓶， 臨用前加入 5mL 蒸餾水，充分溶解待用，4℃保存；用不完的試劑 4℃保存；

試劑二：液體 12mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三 A 液：液體×1 支，4℃保存；

試劑三 B 液：液體×1 瓶，4℃保存；臨用前將 A 液倒 入 B 液中混合，待用；用不完的試劑 4℃保存一周；

試劑四：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量 （104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 578nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)

混勻，放入 37℃水浴 1h 后，10000g 25℃離心 10min，取上清液。

2、將上清液稀釋 10 倍（取 0.1mL 上清液，加入 0.9mL 蒸餾水）。

3、測(cè)氨量（在 1ml 比色皿中加入下列試劑）

充分混勻，室溫放置 20min

混勻，于 578nm 處，蒸餾水調(diào)零，讀吸光值 A ，計(jì)算 ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

UE 活力計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 0.0915x +0.0373 ；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL），y為吸光值A(chǔ)。

1、血清（漿） UE 活力的計(jì)算:

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘產(chǎn)生 1μg NH3-N 定義為一個(gè)酶活力單位。

UE 活力(μg/min/mL）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V 反總÷V 樣÷T

=27.32×(ΔA -0.0373)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 1μg NH3-N 活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1μg NH3-N 定義為一個(gè)酶活力單位。

UE  活力(μg/min/mg  prot）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V  反總÷(V 樣×Cpr)÷T  

=27.32×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1μg NH3-N 定義為一個(gè)酶活力單位。

UE 活力(μg/min/ g  鮮重）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=27.32×(ΔA -0.0373) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1μg NH3-N 定義為一個(gè)酶活力單位。

UE 活力(μg/min/10⁴ cell）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷

T=0.0546×ΔA  10：稀釋倍數(shù)；T：反應(yīng)時(shí)間，60min；

V 反總：反應(yīng)體系總體積：0.3mL；V 樣：加入反 應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V 樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量， g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。