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可溶性淀粉合成酶試劑盒說明書（分光光度法-25管/24樣）

貨號(hào)：LE-1-090

測(cè)定意義

SSS（EC 2.4.1.21）通常以游離態(tài)存在于質(zhì)體基質(zhì)中，催化淀粉鏈延長(zhǎng)，主要負(fù)責(zé)支鏈淀粉的合成。

測(cè)定原理

SSS 催化 ADPG 與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng)，將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時(shí)生成 ADP， 在反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化 NADP+還原為  NADPH，NADPH 生成量與前一步反應(yīng)中ADP 生成量呈正比，340nm 下測(cè)定 NADPH 增加  量即可計(jì)算 SSS 活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、 1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液： 液體 30mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一 ：25mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二 ：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入 7mL 試劑一充分混勻備用； 用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三 ：粉劑×1瓶，4℃保存； 臨用前加入 4mL 試劑一充分混勻備用； 用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四 ：粉劑×1瓶，4℃保存； 臨用前加入 9mL 試劑一充分混勻備用； 用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑五：液體×1支，-20℃保存；臨用前加入 0.5mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑 分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入 0.5mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑 分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

粗酶液制備

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。 10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在 EP 管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫 20 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻

混勻，30℃保溫 30 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻， 10000g 4℃離心 10min，取上清液（如果一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑四、五和六按比例配成混合液）

混勻后立即 340 nm 波長(zhǎng)下記錄初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。 

注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。

SSS 活性計(jì)算

1 、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

SSS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T×稀釋倍數(shù)

=529×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SSS 活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T×稀釋倍數(shù)

=529×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，7.8×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³  L / mol /cm；d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.15 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)： 1.9；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度， mg/mL；W：樣本質(zhì)量。