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肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT1）測試盒說明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-153

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶是存在于線粒體內(nèi)膜的一類?；D(zhuǎn)移酶。可逆地催化從?；o酶 A 將?；D(zhuǎn)移至 L-肉毒堿的反應(yīng)，在轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸通過線粒體內(nèi)膜的過程中起重要作用。

測定原理：

基于肉堿和脂酰輔酶 A 在丙二酰輔酶 A 存在與否的條件下，通過肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-I)的作用，產(chǎn)生脂酰肉堿，并釋放出巰基輔酶 A(COA-SH)，與 Ellman 試劑 DN-TB 反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的 TNB。通過其吸收峰值得變化（412nm），來定量分析 CPT-1 的活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體 50mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：液體 10mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：液體 1mL×1 支，-20℃保存；

試劑四：液體 55mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

① 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿液于 600g，4℃離心 5min。

③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

④ 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 CPT-1（此步可選做）。

⑤ 在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 CPT-1 測定。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

①   在試劑五中加入 2mL 無水乙醇，混勻，再加入 44mL 試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

②   在試劑六中加入 2mL 蒸餾水，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

③   在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本、880μL 試劑五和 40μL 試劑六，混勻，記錄 412nm 處 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

CPT-1 活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr 

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=177.8×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.3556×ΔA 

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.6×10^-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T： 反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。