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海藻糖-6-磷酸酯酶（TPP） 試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-225

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

海藻糖又稱為漏蘆糖、蕈糖，是由兩個葡萄糖分子組成的一個非還原性雙糖，能夠在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下在細(xì)胞表面形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)生物分子結(jié)構(gòu)不被破壞，從而維持生命體的生命過程和生物特征。

植物體內(nèi)主要以葡萄糖為底物合成海藻糖，海藻糖-6-磷酸酯酶（trehalose 6-phosphate phosphatase，TPP）是該途徑中海藻糖合成關(guān)鍵酶之一，該反應(yīng)首先在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）的作用下，催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和 6-

磷酸葡萄糖生成中間產(chǎn)物6-磷酸海藻糖，再在TPP的作用下去磷酸化，生成海藻糖。

測定原理：

TPP 催化海藻糖-6-磷酸產(chǎn)生海藻糖，同時釋放出磷酸根，使用鉬銻抗比色法測定。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿 、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 6mL×1 支，4℃保存。

試劑三： 粉劑×1 支，4℃避光保存。臨用前加 2mL 蒸餾水溶解。用不完的試劑 4℃保存。

試劑四： 粉劑×3 支，4℃避光保存。臨用前加 1mL 蒸餾水溶解。現(xiàn)配現(xiàn)用。

樣品測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù)30 次）；8000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），冰浴中勻漿。8000g ，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、在EP 管中加入如下試劑

混勻，37℃反應(yīng) 30min，95℃水浴 5min 終止反應(yīng)，冷卻至室溫。10000g 4℃離心 5min，取反應(yīng)液待測。

2、顯色液的配制（可測 10 管）：取 EP 管一支，加入 660μL 試劑二，再加入 100μL 試劑三，充分混勻后，再加入 240μL 試劑四，充分混勻待用；配好的顯色液應(yīng)為黃色，若變藍(lán)則為磷污染；顯色液必須現(xiàn)配現(xiàn)用；

3、在 1mL 玻璃比色皿中加入如下試劑

測定 660nm 處吸光值A(chǔ)，分別記為A 對照和 A 測定，△A=A 測定-A 對照。

TPP 活力計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y = 3.8806x - 0.0036，R² = 0.9985；其中 x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL，y 為吸光值△A。

1、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 無機(jī)磷定義為一個酶活力單位。

TPP 活力( nmol/min/mg prot)=（ΔA+0.0036）÷3.8806×V 反總÷（V 樣×Cpr ）÷T× 1000

=17.18×（ΔA+0.0036） ÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 無機(jī)磷定義為一個酶活力單位。

TPP 活力(nmol/min/g 鮮重)=（ΔA+0.0036）÷3.8806×V 反總÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T× 1000

=17.18×（ΔA+0.0036）÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 無機(jī)磷定義為一個酶活力單位。

TPP 活力(nmol/min/10⁴ cell)=（ΔA+0.0036）÷3.8806×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量）÷T× 1000

=0.034×（ΔA+0.0036）

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V 樣：加入樣本體積，0.15 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；細(xì)胞數(shù)量，500 萬；1000，μmol 到 nmol 的換算系數(shù)。