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順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-226                                                       

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

順烏頭酸酶（aconitase），三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕?。檸檬酸本身不易氧化，在順烏頭酸酶作用下，通過脫水與加水反應(yīng)，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進一步的氧化脫羧反應(yīng)作準(zhǔn)備。

測定原理

ACO 催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將 NAD+  還原生成NADH，導(dǎo)致 340nm處光吸收上升。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：50mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：10mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：1mL×1 支，-20℃保存；

試劑四：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加 3mL 蒸餾水充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用

試劑七：粉劑×1 支，4°保存；臨用前加 36mL 試劑四充分溶解；

工作液：臨用前在 36mL 試劑七中加入 3mL 蒸餾水、3mL 試劑四、3mL 試劑五、3mL 試劑六充分混勻

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿轉(zhuǎn)入離心管內(nèi) 600g，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、上清液即胞漿提取物，可用于測定胞質(zhì)順烏頭酸酶活性。

5、在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體順烏頭酸酶活性測定。

測定步驟

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）將工作液，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20°保存，一星期內(nèi)可用。

（2）在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 樣本 900μL 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s時的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2，計算ΔA=A2-A1。

ACO 活性計算

用石英比色皿測定的計算公式如下

1、按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活性單位。

ACO 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T

=536×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活性單位。

ACO（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=108×ΔA÷W

3、按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活性單位。

ACO 活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.722×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.001 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T： 反應(yīng)時間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。