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果糖激酶(fructokinase，F(xiàn)RK)試劑盒說明書（可見分光光度法）

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

蔗糖是大多數(shù)高等植物從源到庫運輸?shù)闹饕问? 但進入庫器官后被分解為果糖和葡萄糖, 果糖在進入下一步代謝前必須由果糖激酶或己糖激酶進行磷酸化，以幫助庫組織的建立和庫強的提高，而果糖激酶是催化果糖磷酸化的主要酶。此外，果糖激酶還可以作為植物的己糖感受器和信號分子，通過影響植物的生長周期來調(diào)控植物的代謝和生長發(fā)育進程，果糖激酶在庫組織中發(fā)揮重要的作用。因此，研究果糖激酶對研究植物中果糖代謝調(diào)節(jié)機制具有十分重要的意義。

測定原理

FRK 催化果糖合成 6-磷酸果糖，6-磷酸果糖在磷酸己糖異構酶的作用下異構為 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步催化 6-磷酸葡萄糖脫氫生成 NADH，NADH 在 340nm 有特征吸收峰。

需自備的儀器和用品

分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 50 mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 30mL 試劑一充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 7mL 試劑一充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四：液體 70μL×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 7mL 試劑一充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

樣本的前處理

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟

1、 分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 配好的試劑于 25℃預熱 10min。

3、 樣本測定

在 1mL 石英比色皿中依次加入加入 250μL 樣本、500μL 試劑二，125μL 試劑三，125μL 試劑四，混勻，立即記錄 340nm 處 30s  時的吸光值 A1 和 5min30s 后的吸光值 A2，計算ΔA=A2-A1。

注意：若 ΔA 大于 0.5，需將酶液用提取液稀釋，計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)?；?qū)⒎磻獣r間縮短至 2min，使 A2-A1 小于 0.5，可提高檢測靈敏度。

FRK 活性計算

1、血清（漿）FRK 活性

單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

FRK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=128.6×ΔA

2、組織、細菌或細胞中 FRK 活性

按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

FRK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=128.6×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

FRK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=128.6×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

FRK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.2572×ΔA V 反總：反應體系總體積，1×10-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.25mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。