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內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-120

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

Cx 存在于細(xì)菌、真菌和動物體內(nèi)，是纖維素酶系的組份之一，Cx 主要作用于非晶態(tài)纖維 素和水溶性纖維素衍生物，隨機(jī)水解糖苷鍵，將其分解成葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和其他 寡聚體。

測定原理：

采用 3,5－二硝基水楊酸法測定 Cx 催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 15mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

樣品測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。           

2、組織：按照組織質(zhì)量（ g）：提取液體積(mL)為 1：5 10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

混勻， 90℃水浴 10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，測 540nm 下吸光值 A，計(jì) 算 ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。

Cx 活性計(jì)算

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為 y=6.4078x-0.0673；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y 為吸光值。

2、血清（漿）Cx 活力的計(jì)算

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷V 樣÷T

=14.305× ( ΔA+0.0673)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 Cx 活力的計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg/min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T 

=14.305× ( ΔA+0.0673) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg/min/g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=14.305× ( ΔA+0.0673)÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx 活力(μg/min/10⁴cell)=[1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷ 

T=0.0286× ( ΔA+0.0673)

1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.55mL； V 樣：加入樣本體積，0.05 mL； V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。