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貨號：LE-1-200

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定

測定意義

脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同，分為谷氨酸( Glu)和鳥氨酸( Orn)兩條合成途徑。鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(δ-OAT) 是以鳥氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶，對植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。

測定原理

鳥氨酸和α-酮戊二酸在鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶和 NADH 作用下發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成吡咯啉-5-羧酸（P5C），同時產(chǎn)生 NAD，通過檢測 340nm 處的吸光度的變化可反映出鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的高低。

自備實驗用品及儀器

天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外可見分光光度計、1mL 石英比色皿。

試劑組成和配制

提取液：液體 55mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 70 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加 20mL 試劑一充分溶解；用不完的試劑 4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加 20mL 試劑一充分溶解；用不完的試劑 4℃保存。

試劑四：粉劑×2 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加 10mL 試劑一充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用。

酶液提取

1、組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 10min，取上清置冰上待測。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時間 3min）；然后 4℃，10000g 離心 10min，取上清置冰上待測。

3、液體：直接檢測。

測定操作

1、分光光度計預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 340nm。

2、將配好的試劑二、三、四 37℃預(yù)熱 5min。（注意：粉劑試劑需要自行配制）

3、取 1mL 石英比色皿，依次加入 300μL 試劑二，300μL 試劑三，300μL 試劑四，100μL 粗酶液，充分混勻，記錄 340nm 處初始吸光值和 37℃反應(yīng) 10min 的吸光值 A2，△A=A1-A2。

計算公式

1、按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T

=160.77×ΔA÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

δ-OAT（nmol/min /g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=160.77×ΔA÷W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每 10⁴ 個細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

δ-OAT（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總) ÷T

=160.77×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4、按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

δ-OAT（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T

=160.77×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g