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貨號：LE-1-205

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

ProDH  是存在于線粒體內(nèi)的催化脯氨酸降解的關(guān)鍵酶。脯氨酸是分布最廣泛的一種滲透物 質(zhì)，在脅迫條件下很多植物可以通過增加合成、減少降解而在體內(nèi)累積大量脯氨酸， 降低 ProDH  活性對于調(diào)節(jié)滲透平衡、防止?jié)B透脅迫對植物造成傷害、清除自由基、保護(hù)細(xì)胞結(jié) 構(gòu)具有重要意義。

測定原理：

利用異硫氰酸甲酯檢測 ProDH 催化的脫氫反應(yīng)，600nm 處吸光值的吸光值的變化反映酶活 性的高低。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一： 液體 2 mL×1 支 ，4℃保存； 

試劑二： 液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存； 臨用前加入 8mL 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；

試劑四：粉劑×1 瓶 ，4℃保存； 臨用前加入 8mL 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；

試劑五：粉劑×5 支，4℃保存；

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿 ， 1500g 4℃離心 15min，取上清液于一支新的EP 管中，加入一滴 試劑一（用 10 μL 的槍頭加入）， 渦旋混勻，冰浴放置 30min 后， 16000g  4℃離心 20min，取上清置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 600nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）混合液的配制：首先將試劑三和試劑四配成溶液（見試劑的組成和配制），臨用前根據(jù) 用量按照試劑二（V）：試劑三（V）：試劑四（V）=7.2（mL）：0.9（mL）：0.9（mL）的比例 充分混勻。（注意： 現(xiàn)配現(xiàn)用，用多少配多少），置于 30℃水浴5min；

（2）試劑五的配制：取試劑五一支，臨用前加入 1mL 蒸餾水充分溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）1mL 玻璃比色皿中加入 175μL 樣本、75μL 試劑五和750μL 混合液，混勻，立即記 錄 600nm 處初始吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2 ，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

ProDH 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中使 600nm 處吸光值變化 0.01 為一個(gè) 酶活力單位。

ProDH（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T

=57.14×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中使 600nm 處吸光值變化 0.01 為一個(gè) 酶活力單位。

ProDH（U/g  鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T

=57.14×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1mL； V 樣：加入樣本體積，0.175mL；V 樣總：加入提取液體 積， 1 mL； T：反應(yīng)時(shí)間， 10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。