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貨號：LE-1-223

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

海藻糖是功能性低聚糖，具有非還原性、保濕性、熱酸穩(wěn)定性、抗凍結性等特性，是細胞在不良環(huán)境條件下產生的一種重要的抗逆應激物之一，它對生物大分子和生物體組織有著非特異性的保護作用。海藻糖合成酶（Trehalose Synthase）催化麥芽糖合成海藻糖，是海藻糖生物合成的關鍵途徑之一。

測定原理：

TS 催化麥芽糖產生海藻糖，使用糖化酶分解剩余麥芽糖為葡萄糖，通過葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量，按照麥芽糖減少的量表示海藻糖合酶活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 6ml×1 瓶，4℃保存，充分混勻，如有沉淀，靜置后取上層清液使用；

試劑三：液體 25ml×1 瓶，4℃避光保存；

試劑四：液體 25ml×1 瓶，4℃避光保存；

樣品測定的準備：

1、細菌或細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量 （10⁴ 個） ：提取液體積（mL）為 500~ 1000： 1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液） ，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W ，超聲 3S ，間隔 10S ，重復 30 次）；8000g ，4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

2、組織的處理：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1mL 提取液），冰浴中勻漿。8000g  ，4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、在  EP 管中加入如下試劑

混勻，40℃水浴反應 2h ，95℃水浴 10 分鐘終止反應，冷卻至室溫。

混勻，60℃過夜反應，10000g 25℃離心 10min ，取上清待測。

2、工作液配制：臨用前將試劑三和試劑四按照 1:1 的比例混合，用多少配多少。

3、在 1mL 玻璃比色皿中加入如下試劑

混勻，室溫反應 30min ，于 505nm 下測定吸光值 A 對照與 A 測定，ΔA=A 對照-A 測定。

每個測定管設一個對照管。

TS 活力計算：

1、標準條件下測定回歸方程為 y = 0.747x - 0.0014，R² = 0.9999；x 為標準品濃度(μmol/mL）， y 為吸光值。

2、按照蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol 麥芽糖產生 1nmol 海藻糖定義為一個酶活力單位。

TS 活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0014) ÷0.747×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000÷2 

= 16.7×(ΔA+0.0014) ÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化 1nmol 麥芽糖產生 1nmol 海藻糖定義為一個酶活力單位。

TS 活力(nmol/min/g  鮮重)=(ΔA+0.0014) ÷0.747×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000÷2 

= 16.7×(ΔA+0.0014)÷W

4、按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化 1nmol 麥芽糖產生 1nmol 海藻糖定義為一個 酶活力單位。

TS 活力(nmol/min/10⁴ cell)=(ΔA+0.0014) ÷0.747×V 反總÷(500 ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000÷2 

=0.033×(ΔA+0.0014)

V 樣：加入樣本體積：0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；V 反總：反應體系總體積， 0.3mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬； T ：反應時間，120min；1000 ，μmol 到 nmol 轉換系數(shù)；2 ，1 分子麥芽糖轉化為 2 分子葡萄糖。