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ABTS 自由基清除能力檢測試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-178

產(chǎn)品內(nèi)容： 使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致， 有疑問請及時聯(lián)系工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入 3 mL 蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑可分裝-20℃保存， -20℃可保存兩周；

2、 試劑三工作液的配制： 液體置于棕色試劑瓶中 EP 管內(nèi)， 臨用前根據(jù)樣本量按試劑三（μL）：蒸餾水（mL）=1 μL:12 mL 的比例配成試劑三工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配，用不完的試劑放于 4℃保存；

3、 試劑四工作液的配制： 可先將試劑四-20℃分裝保存。 臨用前根據(jù)樣本量按試劑四： 試劑一（V:V）=1:9 的比例配成試劑四工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4、 試劑五：粉劑置于試劑瓶內(nèi) EP 管中，含有 5 mg 維生素 C。臨用前加入 2.8 mL 提取液，充分振蕩溶解； 配成 10 mmol/L 維生素 C 溶液，用于陽性對照。 4℃可保存一周。

5 、 ABTS 工作液的配制： 臨用前根據(jù)樣本量按試劑一： 試劑二： 試劑三工作液（V:V:V）=76:5:4 的比例配成 ABTS 工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫避光保存， 務(wù)必在 30 分鐘內(nèi)使用。

產(chǎn)品說明：

ABTS 法可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測定， 是使用最廣泛的間接檢測方法。 ABTS 經(jīng)氧化后生成穩(wěn) 定的藍綠色陽離子 ABTS 自由基， 在 405 nm 或 734 nm 處有最大吸收峰。被測物質(zhì)加入 ABTS 自由基溶液后， 所 含抗氧化成分能與 ABTS 自由基發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色， 405 nm 的吸光度下降， 在一定范圍內(nèi)其吸光度的變 化與自由基被清除的程度成正比。本試劑盒中， 通過測定吸光度下降的程度來反映樣本清除 ABTS 自由基的能力。

注意： 實驗之前建議選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

恒溫水浴鍋、可見分光光度計、 1 mL 玻璃比色皿、臺式離心機、研缽/粉碎機、烘干箱、 30~50 目篩和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量， 具體比例可以參考文獻）

1、植物組織樣本的制備： 將新鮮樣品置于 60℃烘箱烘干至恒重，研缽研碎（或粉碎機粉碎），過 30~50 目篩； 稱取約 0.05 g 樣本， 加入 1 mL 提取液后置于 40℃水浴鍋中浸提 30 min；10000 rpm  室溫離心 10 min，取上清，  置于冰上待測。

2、紅酒、果汁等液體樣本：吸取 100 μL 樣本溶液加入900 μL 提取液，旋渦振蕩混勻，室溫 10000 rpm 離心 10 min， 取上清，置冰上待測。

3、提取物或者藥物：可用提取液配制成一定濃度，如 5 mg/mL。

注意：不同樣本清除 ABTS 自由基的能力可能相差很大， 為保證實驗結(jié)果的準確性， 樣本要根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果 進行適當調(diào)整（如清除率大于 90%，建議將提取的樣本用提取液進行稀釋； 清除率小于 5%，建議加大烘干樣本 質(zhì)量或液體樣本體積進行提?。?/span>

二、測定步驟

1.  分光光度計預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長至 405 nm，蒸餾水調(diào)零。

2.  陽性對照的準備： 若需要線性關(guān)系， 建議將 10 mmol/L 的維生素 C 溶液用提取液配制成 1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL 的維生素 C 溶液待用； 若需要清除率約為 90%的陽性對照，則建議將 10 mmol/L 維生素 C 溶液用提取 液配制成大于 1.5 mmol/L 的維生素 C 溶液待用。

3.  操作表：在 EP 管中分別加入下列試劑：

三、 ABTS 自由基清除率的計算

1.    標準曲線的建立：

陽性對照的自由基清除率計算公式：

ABTS 自由基清除率 DVC%=[(A 空白-A 陽性對照)÷A 空白]×100%

2.    樣本的自由基清除率計算公式：

ABTS 自由基清除率D% =[A 空白-(A 測定-A 對照)]÷A 空白×100%。

注意事項：

1、不同樣本清除 ABTS 自由基的能力可能相差很大， 如果要比較不同樣品的 ABTS 自由基清除能力， 建議對于同 一批樣品加入等量的樣品， 紅酒、組織勻漿、果汁等液體樣品加入同樣體積， 提取物（或者藥物） 配制成同樣濃度。 在比較時，將樣本根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果進行適當調(diào)整，比較同樣濃度（相同稀釋倍數(shù)）的清除率大小。

2、樣品建議當天提取當天檢測。