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淀粉脫分支酶（DBE）試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法 ）

貨號(hào)：LE-1-087

測(cè)定意義

DBE 能夠?qū)Ｒ恍缘亓呀庵ф湹矸鄣?/span>α- 1，6 糖苷鍵， 產(chǎn)生線性的葡萄糖鏈，在調(diào)整支鏈淀粉 分子的鏈長(zhǎng)方面有重要的作用。

測(cè)定原理

采用 3 ，5-二硝基水楊酸法測(cè)定 DBE 催化支鏈淀粉產(chǎn)生的還原糖，通過(guò)測(cè)定還原糖含量的 變化來(lái)計(jì)算 DBE 活性。

需自備的的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)、 水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研缽、冰、  蒸 餾

試劑的組成和配制

提取液： 液體 60mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑一： 液體 15mL×1 瓶 ，4℃保存；

試劑二： 粉劑 × 1 支，4℃保存； 臨用前每支加入 6mL 試劑一 ，充分混勻后備用； 用不完的 試劑 4℃保存；

試劑三： 液體 12mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑四： 液體 35mL×1 瓶 ，4℃保存。

粗酶液提取

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 540 nm，蒸餾水調(diào)零。 

2、加樣表

混勻， 37℃準(zhǔn)確保溫 2h

混勻， 95℃水浴 5min，于 1mL 玻璃比色皿 540nm 處讀取各管吸光值。  ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照。

每個(gè)測(cè)定管需設(shè)個(gè)一個(gè)對(duì)照管。

注意： 可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進(jìn)行 5min 95℃沸水浴處理。 

DBE 活力單位的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定回歸方程為 y= 3.8458x - 0.165；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ mg/mL），y 為吸光值。 

1、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每 h 催化產(chǎn)生 1mg  葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

DBE 活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T=0.26 × (ΔA+0.165) ÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1mg  葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

DBE 活力(mg /min /g 鮮重)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=0.26 × (ΔA+0.165) ÷W

V 反總： 反應(yīng)體系總體積， 0.4mL；  V 樣： 加入樣本體積，  0.2mL；V 樣總：  加入提取液體 積， 1 mL； T：反應(yīng)時(shí)間，  2 h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度， mg/mL；W：樣本質(zhì)量，  g。

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為 0.1mg/mL-1mg/mL。

ΔA 線性范圍為 0.01-2。