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淀粉磷酸化酶試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-088

測定意義：

淀粉磷酸化酶（Starch Phosphorylase ，SP）是淀粉代謝過程唯一的可逆反應(yīng)酶，既可催 化淀粉的合成， 也可催化淀粉的分解。

在高等植物中， 淀粉磷酸化酶（合成方向） 主要存在于質(zhì)體中， 負(fù)責(zé)延長淀粉的 α- 1,4- 葡萄糖鏈的非還原末端； 淀粉磷酸化酶（分解方向）主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，催化淀粉中 的 α- 1,4-糖苷鍵磷酸解產(chǎn)生葡萄糖- 1-磷酸，負(fù)責(zé)葡萄糖鏈的磷酸解，是淀粉代謝過程中的關(guān) 鍵酶。

在植物體中，淀粉磷酸化酶分解方向的底物無機(jī)磷濃度比合成方向的底物葡萄糖- 1-磷 酸濃度幾乎高了兩個數(shù)量級， 一般認(rèn)為淀粉磷酸化酶只催化淀粉的分解，因此，分解方向的 淀粉磷酸化酶具有重要測定意義。

測定原理：

淀粉磷酸化酶催化淀粉中的 α- 1,4-糖苷鍵與無機(jī)磷反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖- 1-磷酸，葡萄糖- 1-磷酸在 磷酸葡萄糖變位酶的作用下產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸， 并在 6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化下還原 NADP+產(chǎn)生 NADPH，使 340nm 下吸光值增加。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑一：液體 50mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二： 粉劑×1 瓶， -20℃保存； 臨用前加入 3mL 水溶解， 用不完的試劑分裝后-20℃保存；

試劑三： 粉劑×1 支， -20℃保存； 臨用前加入 3mL 水溶解， 用不完的試劑分裝后-20℃保存。

樣本的前處理：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液） 進(jìn)行冰浴勻漿， 然后 10000g ，4℃, 離心 10min，取上清待測。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時間 3min）；然后 10000g ，4℃, 離心 10min，取上清置于冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零；

2、工作液的配制：臨用前將試劑一、試劑二、試劑三按照每個樣本 850μL:50μL:50μL 的比 例混合，臨用前配制，半小時內(nèi)使用。

3、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 950μL 工作液， 立即混勻， 記錄 340nm 處 1min 時的吸光值 A1 和 6min 時的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

SP 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義： 每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

SP（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=943×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位定義： 每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

SP（nmol/min/g  鮮重） =[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T =943×ΔA÷W

3、按樣本鮮重計(jì)算

單位定義： 每萬個細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

SP（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V 樣÷V 樣總)÷T =1.886×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1×10^-3  L；ε ：NADPH 摩爾消光系數(shù)， 6.22×10³  L / mol /cm；d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL；T： 反應(yīng)時間， 5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度， mg/mL；W：樣本質(zhì)量， g；細(xì)胞數(shù)量， 500 萬。