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蘋果酸合酶（malate synthase ，MS）試劑盒說明書（可見分光光度法）

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

規(guī)格：50管/48樣

測定意義：

蘋果酸合酶（MS，EC 4.1.3.2 ）是屬于轉(zhuǎn)移酶中酰基轉(zhuǎn)移酶的一類， 主要存在于植物和微生物中。MS 是乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，在MS 催化下乙醛酸與乙酰輔酶A 反應(yīng)生成蘋果酸。 

測定原理：

MS 催化乙酰 CoA 和乙醛酸產(chǎn)生蘋果酸，同時生成輔酶 A，輔酶 A 使無色的 DTNB 轉(zhuǎn)變成 黃色的 TNB，在 412nm 處有特征吸光值。

需自備的儀器和用品：

分光光度計、臺式離心機(jī)、水浴鍋、 可調(diào)式移液器、1mL  玻璃比色皿、研缽、冰、和蒸餾 水

試劑組成和配制：

試劑一：液體 100 mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二：液體 25 mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 25mL 試劑一充分溶解后使用，用不完的試劑 分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：粉劑×1 瓶， 4℃保存；臨用前加入 6 mL 試劑一充分溶解后使用，用不完的試劑分 裝后-20℃保存， 禁止反復(fù)凍融；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量 （104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL   試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴， 功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清， 置冰上待測。

2、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1 、分光光度計預(yù)熱 30min 以上， 調(diào)節(jié)波長至 412nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 100μL 樣本、400μL 試劑二， 400μL 試劑三和 100μL 試 劑四，混勻，立即記錄 412 nm 處反應(yīng) 5min 時的吸光值 A1 和 10min 時的吸光值 A2，計算 ΔA=A2-A1。

MS 活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。 MS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷(ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=147×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

MS（nmol/min /g  鮮重）=[ΔA×V 反總÷(ε×d）×109]÷（W ×V 樣÷V 樣總） ÷T=147×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

MS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷(ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.294×ΔA

V 反總： 反應(yīng)體系總體積，1×10-3  L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)， 1.36×104  L / mol /cm；d：比 色光徑，1 cm；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總： 加入提取液體積， 1 mL；T：反應(yīng) 時間， 5  min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度， mg/mL；W：樣本質(zhì)量， g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)， 500 萬。