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β-葡聚糖含量試劑盒說(shuō)明書(shū)(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-128

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

β-葡聚糖是由葡萄糖單位組成的多聚糖，它們大多數(shù)是通過(guò)β-1,3結(jié)合，天然存在于真菌、細(xì)菌和植物的細(xì)胞壁中。

測(cè)定原理：

依次使用地衣聚糖酶和β-葡萄糖苷酶水解β-葡聚糖生成葡萄糖，然后使用GOD-POD 試劑測(cè) 定葡萄糖的含量。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、乙醇和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 75μL×1 瓶，4℃避光保存；臨用前加入 1.5mL 試劑一，充分溶解待用，用不 完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：液體 6mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃避光保存；臨用前加入 3mL 試劑四，充分溶解待用，用不完的試 劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑六：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存；

試劑七：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、燕麥、小麥、纖維等干樣：

樣本充分烘干粉碎，過(guò) 40  目以上篩。取 0.05g 左右樣本，加入 1mL 80%乙醇，充分震 蕩混勻后，95℃水浴加熱 5min 。取出冷卻至室溫，25℃ 3000g 離心 10min ，去除上清。

沉淀中加入 0.8mL 試劑一，充分震蕩混勻，95℃水浴加熱 5min 。取出冷卻至室溫，加 入 50μL 試劑二，混勻后 50℃反應(yīng) 60min。

反應(yīng)結(jié)束后加入 1mL 試劑三，充分混勻，25℃ 5000g 離心 10min ，取上清待測(cè)。

2、發(fā)酵液等液體樣本：

取 0.5mL 樣本，95℃水浴加熱 5min 。取出冷卻至室溫后，分次緩慢加入 0.8mL 95%乙 醇，充分混勻，25℃ 3000g 離心 10min ，去除上清。沉淀中再加入 0.8mL 50%乙醇，混勻后 再次 25℃ 3000g 離心 10min ，去除上清。

沉淀中加入 0.8mL 試劑一，再加入 50μL 試劑二，混勻后 50℃反應(yīng) 60min。反應(yīng)結(jié)束后 加入 1mL 試劑三，充分混勻，25℃ 5000g 離心 10min ，取上清待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min ，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 505nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、顯色液配制：臨用前將試劑六和試劑七按 1:1 的比例混合，用多少配多少

3、按下表在 EP 管中加入如下試劑

在 EP 管中加入如下試劑

充分混勻，37℃反應(yīng) 30min ，轉(zhuǎn)移至 1mL 玻璃比色皿中測(cè)定 505nm 處吸光值，記為 A 對(duì)照 和 A 測(cè)定， △A=A 測(cè)定-A 對(duì)照。

β-葡聚糖含量計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 4.642x + 0.0053 ，R² = 0.9999；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL）， y 為吸光值。

1、按樣本質(zhì)量計(jì)算

β-葡聚糖含量(mg/g  干重)=(ΔA- 0.0053) ÷4.642×V1÷(W ×V2÷V3) 

= 0.797×(ΔA-0.0053) ÷W

2、按樣本體積計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol  對(duì)硝基酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-葡聚糖含量(mg/mL)=(ΔA- 0.0053) ÷4.642×V1÷(V4×V2÷V3)

= 1.594×(ΔA-0.0053)

V1：反應(yīng)總體積，0.2mL；V2：反應(yīng)體系中樣本體積，0. 1 mL；V3:提取液總體積，1.85 mL； V4：液體樣本體積，0.5mL；W：樣本質(zhì)量，g。