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亮氨酸氨基肽酶（Leucine Aminopeptidase, LAP） 試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-207

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

LAP 是一類能水解肽鏈 N-末端為亮氨酸的酶，廣泛存在于肝、腎、胰等組織中，尤其以肝 臟中含量最為豐富。各類肝病患者因肝細(xì)胞損傷，血清 LAP  的活性均有不同程度的升高， 因此，血清 LAP 活性的檢測(cè)能從不同側(cè)面反映各種肝病的發(fā)生和發(fā)展。

測(cè)定原理：

LAP 分解 L-亮氨酰對(duì)硝基苯胺生成對(duì)硝基苯胺 ，后者在 405nm有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸 光值升高速率來(lái)計(jì)算 LAP 活性。

自備用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 40mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 1000~5000： 1 的比例（建議 2000 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。 

LAP 測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 405nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑二轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解（如較難溶解，可 50℃水浴加熱約30min 促進(jìn)溶解）； 在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上；用不完的試劑分裝后-20℃  保存，禁止反復(fù)凍融。

3、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 250μL 樣本和 750μL 試劑一，混勻后立即記錄 405nm 處初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

注意事項(xiàng)：

若ΔA大于 0.5，需將酶液用提取液稀釋，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。使 A2-A1 小于 0.5 ，可提高檢測(cè)靈敏度。

LAP 活力單位的計(jì)算：

1、血清（漿）LAP 活力的計(jì)算:

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=205.8×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 LAP 活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol  對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。 

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=205.8×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol  對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=205.8×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol  對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。  

LAP（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷(2000×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.103×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：對(duì)硝基苯胺摩爾消光系數(shù)，9.72×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.25 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時(shí)間，2  min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞  總數(shù)，2000 萬(wàn)。