產(chǎn)品名稱：吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)測試盒
產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣,100管/48樣
產(chǎn)品貨號：LE-1-262,LE-2-262
產(chǎn)品報(bào)價(jià)：
免費(fèi)咨詢：0551-66107970
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
檢測方法 |
規(guī)格 |
售價(jià)（元） |
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LE-1-262 |
吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)測試盒
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紫外分光光度法 |
50管/24樣 |
850 |
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LE-2-262 |
吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)測試盒 |
微量法 |
100管/48樣 |
1500 |
吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）試 劑盒說明書(微量法)
測定意義：
吡咯啉-5-羧酸還原酶( P5CRs) 是普遍存在于原核和真核生物中的一類重要的管家蛋白。其 主要功能是催化脯氨酸生物合成的最后一步反應(yīng)，將吡咯啉-5-羧酸( P5C) 轉(zhuǎn)化為脯氨酸， 在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等一系列病理和生理過程中起著重要作用。
測定原理：
P5CR 具有噻唑烷-4-羧酸脫氫酶活性，催化噻唑烷-4-羧酸的脫氫反應(yīng)，同時(shí)將NAD轉(zhuǎn)化為NADH ，使 WST-8 變成橙黃色，測定 450nm 下吸光值增加速率來反映酶的活性。
需自備的儀器和用品：
酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；
試劑四：液體 1.5mL×1 瓶，4℃避光保存。
粗酶液提?。?/b>
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)） ：提取液體積（mL）為 500~ 1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W ，超聲 3s ，間隔 10s ，重復(fù) 30 次）；12000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1 、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 450nm。
2 、樣本測定
（1）臨用前在試劑二中加入 12mL 試劑一，試劑三中加入 6mL 試劑一，充分溶解混勻，用 不完的試劑分裝后-20℃保存；
（2）工作液的配制：臨用前按照樣本數(shù)量，按以下比例配制工作液，配制后避光保存并在 30min 內(nèi)使用
試劑名稱 (μL）
測定工作液
對照工作液
試劑一
90
試劑二
90
90
試劑三
90
試劑四
10
10
（3）按下表在 96 孔板中加入如下試劑
試劑名稱 (μL）
測定管
對照管
樣本
10
10
測定工作液
190
對照工作液
190
37℃避光孵育 30min，450nm 下測定吸光值 A 測定與 A 對照，△A=A 測定-A 對照。
每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對照管。
P5CR 活性計(jì)算：
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為 y = 0.6692x - 0.0285，R2 = 0.999； x 為 NADH 含量(μmol/mL）， y 為吸光值。
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
P5CR（nmol/min/mg prot）= (△A+0.0285)÷ 0.6692×V 樣÷(V 樣×Cpr)×1000÷T
= 49.8×(△A+0.0285) ÷Cpr
2、按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
P5CR（nmol/min/g 鮮重）= (△A+0.0285)÷ 0.6692×V 樣÷(W ×V 樣÷V 樣總） ×1000÷T
= 49.8×(△A+0.0285) ÷Cpr
3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
P5CR（nmol/min/104 cell）= (△A+0.0285)÷ 0.6692×V 樣÷(500×V 樣÷V 樣總)×1000÷T
=0.0996×(△A+0.0285)
V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T ：反應(yīng)時(shí)間，30 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬；1000， μmol 到 nmol 的換算系數(shù)。
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