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線粒體 H+-ATP 酶試劑盒說明書（分光光度法）

測定意義：

線粒體 H+-ATP 酶的功能主要是合成 ATP  和轉(zhuǎn)運(yùn) H+，在線粒體呼吸鏈中耦聯(lián) ATP  的合成，為機(jī)體提供能量。 

測定原理：

H+-ATP  酶水解 ATP 產(chǎn)生 ADP 和無機(jī)磷，通過測定無機(jī)磷增加速率來測定 H+-ATP  酶活性。 

需自備的儀器和用品：

分光光度計、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。 

試劑的組成和配制：

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 1.5mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑四：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 3mL 蒸餾水，充分溶解待用。 

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 3mL 蒸餾水，充分溶解待用。 

試劑七：液體 6mL×1 支，4℃保存。

試劑八： 粉劑×1支，4℃避光保存。臨用前加 2mL 蒸餾水溶解。用不完的試劑 4℃保存。

試劑九： 粉劑×3支，4℃避光保存。臨用前加 1mL 蒸餾水溶解。現(xiàn)配現(xiàn)用。

定磷試劑的配制：取 EP 管一支，加入 660μL 試劑七，再加入 100μL 試劑八，充分混勻后， 再加入 240μL 試劑九，充分混勻待用。配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效， 若是藍(lán)色則為磷污染（請根據(jù)需要，用多少配多少，現(xiàn)配現(xiàn)用）。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿， 以避免磷污染。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1 、 準(zhǔn)確稱取 0. 1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10μL  試劑三，用冰浴勻漿 器或研缽勻漿。

2 、 將勻漿 600g ，4℃離心 5min。

3 、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g ，4℃離心 10min。

4 、 步驟 3 中的沉淀即為線粒體，加入 200μL 試劑二，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超聲 3s ，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 H+-ATP 酶活性測定。

測定步驟：

1 、 分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 660nm ，蒸餾水調(diào)零。

2 、 樣本測定

在 EP 管中加入如下試劑

在 96 孔板中加入下列試劑

混勻，靜置 10min 后，在 660nm 處讀取 A 測定管和 A 對照管，計算ΔA=A 測定管-A 對照 管。

H+-ATP 酶活力單位的計算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y = 0.4746x - 0.0036，R2  = 0.9967；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL）， y 為ΔA 值。

1、按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol  無機(jī)磷定義為一個酶活性單位。

H+-ATP 酶活性（nmol/min /mg prot）=(ΔA+0.0036)÷0.4746×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T×1000=386.29× (ΔA+0.0036) ÷Cpr 此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol  無機(jī)磷定義為一個酶活性單位。

H+-ATP 酶活性（nmol/min /g  鮮重）=(ΔA+0.0036)÷0.4746×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T×1000 =77.25× (ΔA+0.0036) ÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol  無機(jī)磷定義為一個酶活性單位。

H+-ATP 酶 活性（ nmol/min /10⁴  cell ）=(ΔA+0.0036)÷0.4746×V 反 總 ÷(500×V 樣 ÷V 樣 總) ÷T×1000=0. 155×(ΔA+0.0036)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.275mL； V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取 液體積，0.2 mL；T ：反應(yīng)時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量， g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。