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ATP 含量試劑盒說明書(微量法)

貨號：LE-2-295

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

ATP 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是生物能量通貨，能荷是描述細胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測定 ATP 含量并且計算能荷，能夠反映能量代謝狀態(tài)。

測定原理：

肌酸激酶催化肌酸和 ATP 反應生成磷酸肌酸，可在 700nm 下用磷鉬酸比色法檢測磷酸肌酸 含量， 以此反應 ATP 含量。

自備儀器和用品：

分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96 孔板、研缽和蒸餾水。

試劑組成和配制：

酸性提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

堿性提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加入 1mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保 存；

試劑二：液體 1.5mL×1 支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存； 臨用前加入 500μL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃ 保存一周；

試劑四：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：液體 25mL×1 瓶，4℃保存；

標準液：液體 10mL×1 瓶，2μmol/mLATP 標準液，4℃保存；

ATP 提取：

1、血清（漿） 中 ATP 的提取： 按照血清（漿）體積（mL）： 酸性提取液體積（mL）為 1： 5~10 的比例（建議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 酸性提取液），進行冰浴勻漿，8000g 4  ℃離心 10min；取上清液至另一 EP 管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g  4  ℃離心 10min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。

2、組織中 ATP 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 酸性提取液）， 進行冰浴勻漿，8000g  4℃離心 10min，取上清 至另一 EP 管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g  4  ℃離心 10min，取上 清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。

3、細胞或細菌中 ATP 的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù) 量（10⁴ 個）： 酸性提取液體積（mL）為 500~1000： 1  的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 酸性提取液），超聲波破碎 1min（冰浴，強度 20％或 200W，超聲 2s，停 1s），8000g 4 ℃ 離心 10min；取上清液至另一 EP 管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 700nm，蒸餾水調(diào)零。

2、顯色劑的配制： 臨用前請根據(jù)擬用顯色劑體積（樣本數(shù)×0.2 m L）， 按試劑四(mL)：試 劑五（mL）=1： 5 的比例配制。用多少配多少。

3、樣本測定：

充分混勻，37℃準確水浴 30min

37℃水浴 20min 后，700nm 下測定各管吸光值

注意： 空白管和標準管通常只需要各做一個。每個測定管設一個對照管。

ATP 含量計算：

1、血清（漿） 中 ATP 含量計算

ATP 含 量 (μmol/mL)=[C 標 準 管 ×(A 測 定 管 －A 對 照 管 )÷(A 標 準 管 －A 空白 管 ) ×V1]÷(V3×V1÷V2)

=40×(A 測定管－A 對照管)÷(A 標準管－A 空白管)

2 、組織、細菌或細胞中ATP 含量計算

（1）按蛋白濃度計算

ATP 含量(μmol/mg  prot)=[C 標準管×(A 測定管－A 對照管)÷(A 標準管－A 空白管)×V1]÷(V1÷Cpr）

=2 ×(A 測定管－A 對照管)÷(A 標準管－A 空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測定。

（2）按樣本鮮重計算

ATP 含量 μmol/g 鮮重)=[C 標準管×(A 測定管－A 對照管)÷(A 標準管－A 空白管) ×V1]÷(W×V1÷V2)

=4 ×(A 測定管－A 對照管)÷(A 標準管－A 空白管)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

ATP 含量(μmol/10⁴  cell） =[C 標準管×(A 測定管－A 對照管)÷(A 標準管－A 空白管) ×V1]÷(500×V1÷V2)

=0.008×(A 測定管－A 對照管)÷(A 標準管－A 空白管)÷W

C  標準管 ：標準液濃度，2μmol/mL；V1 ：加入反應體系中樣本體積，0.01mL；V2 ：加入  提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W： 樣本質(zhì)量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。

注意： 最低檢測限為 10nmol/mL 或 10nmol/g 鮮重或 0.1nmol/mg prot