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N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（NAG）試劑盒說明（分光光度法）

貨號：LE-1-123

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

NAG 是溶酶體中的一種酸性水解酶，廣泛存在于各種組織、體液和細胞中，以前列腺和腎 近曲小管細胞內(nèi)含量最高。NAG 活性變化與機體某些病理狀態(tài)密切相關(guān)。

測定原理：

NAG 分解 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成對-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過測 定吸光值升高速率來計算 NAG 活性。

自備用品：

可見分光光度計、臺式離心機、 水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試 劑仍-20℃保存。

試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量  （10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）， 進行冰浴勻漿。 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min

充分混勻，400nm 處測定吸光值 A，計算 ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。

NAG 活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y=0.00543x +0.0083；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值。

2、血清（漿）NAG 活力的計算

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。 

NAG 活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V 反總]÷V 樣÷T

=61.39×(ΔA-0.0083)

3、細胞、細菌和組織中 NAG 活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

NAG 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T 

=61.39×(ΔA-0.0083) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

NAG 活性(nmol/min/g 鮮重)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T 

=61.39×(ΔA-0.0083)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

NAG 活性(nmol/min /10⁴cell) =[(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T 

=0.123×(ΔA-0.0083)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V 樣總：加 入提取液體積， 1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細胞或細 菌總數(shù)，500 萬；T：反應(yīng)時間，30min。