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亞鐵氧化酶（HP）試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-391

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

Hephaestin (HP)作為銅藍(lán)蛋白的同系物,是近年來發(fā)現(xiàn)的鐵轉(zhuǎn)運蛋白亞鐵氧化酶，HP 屬亞鐵氧化酶家族成員,具有亞鐵氧化酶的活性,參與體內(nèi)鐵代謝。HP 的表達(dá)可受鐵、銅及鋅等金屬離子的調(diào)節(jié)。HP 催化 Fe²⁺ 氧化生成  Fe³⁺ ，在介導(dǎo)鐵的跨膜轉(zhuǎn)運中有重要作用。

測定原理：

HP 催化 Fe²⁺ 氧化為  Fe³⁺ ， Fe²⁺ 和 ferrozine 反應(yīng)顯色，在 560 nm 下有特征吸光值。通過測定 Fe²⁺  的減少速率可測得亞鐵氧化酶的活性。

自備用品：

可見分光光度計、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存;

試劑二：液體 3 mL×1 瓶，4℃保存;

試劑三：液體 30 mL×1 瓶，4℃避光保存。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：水 mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 蒸餾水）， 進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 560 nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、在玻璃比色皿中加入下列試劑

HP 活性計算:

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 16.427x - 0.0006 ，R²  = 0.9998；(x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y 為吸光值 ΔA) 

1、按樣本質(zhì)量計算

單位定義：每 g 樣本每分鐘氧化 1nmol Fe²⁺ 定義為一個酶活力單位。

HP（nmol/min/g  鮮重）= (△A+0.0006）÷16.427×V 總÷T ÷(W×V 樣÷V 樣總)×1000

= 20.29×(△A+0.0006）÷W

2、按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 蛋白每分鐘氧化 1nmol Fe²⁺ 定義為一個酶活力單位。

HP（nmol/min/mg prot）= (△A+0.0006）÷ 16.427×V 總÷T ÷（Cpr×V 樣）× 1000

= 20.29×(△A+0.0006）÷Cpr

V 總：反應(yīng)體系體積，0.1 mL；V 樣：加入樣本體積 0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，30min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；1000 ，μmol 到 nmol 的轉(zhuǎn)換系數(shù)。