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考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-060

正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。

測(cè)定原理

在酸性溶液中，考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物；該復(fù)合物在 595nm 處有最大吸收 峰， 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。該方法靈敏度高，適合微量蛋白質(zhì)分析。

自備儀器和用品

離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：500μg/mL×1 瓶，4℃保存，臨用前用蒸餾水稀釋為50μg/mL。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取

1、液體樣品：澄清無(wú)色液體樣品可以直接測(cè)定。

2、組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~ 10的比例（建議稱取約 0. 1g組織，加入 1mL提取液（自備，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min ，取上清，即待測(cè)液。（動(dòng)物樣品常常需要稀釋）

3、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為500~ 1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞 加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w ，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g ，4℃ ,離心 10min ，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min ，蒸餾水調(diào)零。

2、空白管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL蒸餾水，1000μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，于595nm比色，10~20min 完成比色，記為A空白管。

3、標(biāo)準(zhǔn)管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL標(biāo)準(zhǔn)液，1000μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，于595nm比色，10~20min 完成比色，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4、測(cè)定管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL待測(cè)液，1000μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，于595nm比色，10~20min完成比色，記為A測(cè)定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。

計(jì)算公式:

Cpr (μg/mL）=50×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管) C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)濃度，50μg/mL。

注意事項(xiàng)：

1、加考馬斯亮藍(lán)后，在 10~20min 內(nèi)吸光值相對(duì)較穩(wěn)定，因此須在 10~20min 完成比色。

2、不宜用石英比色皿，可用玻璃或塑料比色皿，測(cè)完成后立即用 95% 乙醇沖洗。

3、測(cè)定前用 1~2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保蛋白濃度在 0~ 1000μg/ml 范圍內(nèi)，否則需要做相應(yīng)稀釋，使得稀釋 后的結(jié)果在  0~ 1000μg/ml 范圍內(nèi)，然后再乘以稀釋倍數(shù)。