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貨號：LE-1-365

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

哺乳動物 CarE，也稱脂族酯酶（aliesterase），廣泛分布于組織和器官，屬于絲氨酸水解酶家 族。CarE 催化含酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性與外源性物質(zhì)水解，但不能催化水解乙酰 膽堿及其類似物 。CarE  參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝，并且與多種藥物、環(huán)境毒物以及致癌物的解 毒和代謝有關(guān)，有機(jī)磷農(nóng)藥可結(jié)合并且抑制 CarE 活性。

測定原理：

CarE 能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固藍(lán)顯色；在 450 nm光吸收增加速率，計算 CarE 活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、 1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二： 液體 30mL×2 瓶，4℃保存；

試劑三 ：粉劑×2 支，4℃保存，臨用前取 1 支試劑三，加 1.2ml 無水乙醇充分溶解；

試劑四 ：粉劑×2 支，-20℃保存，臨用前取 1 支試劑四，加少量試劑二溶解；

工作液配制：臨用前配制，向 1 瓶試劑二中，加入溶解后的試劑三和試劑四各 1 支，充分溶解，過濾，4℃避光保存，可用 1 周。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞樣品制備

收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 200 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 400μL 試劑一， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 20％，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000g 4℃離心 30min， 取上清液待測。

2、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿； 12000g 4℃離心30min，取上清液待測。

3、液體：直接測定。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 450 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3、空白管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 5μL 蒸餾水和 1000μL 試劑二，迅速混勻，于 450nm 處測定 3min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 吸光值記為 A1，第 190s 吸光值記為 A2。△A 空白管=A2-A1

4、測定管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 5μL 上清液和 1000μL 試劑二，迅速混勻，于 450nm 處測定 3min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 吸光值記為 A3，第 190s 吸光值記為 A4。△A 測定管=A4-A3 

注意：空白管只需測定一次。

CarE 活性計算公式：

1、組織中 CarE 活性

（1）按照蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白在 37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加 1 定義為 1 個酶活單位。

CarE 酶活(U/mg prot)= (△A 測定管-△A 空白管) ×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T = 67×(△A 測定管-△A 空白管)÷Cpr

Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 樣：加入上清液體積，0.005 mL；T：反應(yīng)時間，3min 。V 反 總： 1.005mL； 蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣品質(zhì)量計算

單位的定義：每 g 組織在 37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加 1 定義為 1 個酶活單位。

CarE 酶活(U/g  鮮重)= (△A 測定管-△A 空白管) ×V 反總×（V 樣總÷V 樣）÷W÷T 

= 67×(△A 測定管-△A 空白管)÷W

V 樣總：上清液總體積，1 mL；V 樣：加入上清液體積(mL)，0.005 mL；V 反總：1.005mL； W：樣品質(zhì)量（g）； T：反應(yīng)時間（min），3min。

2、細(xì)菌或細(xì)胞中 CarE 活性

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在 37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加 1 定義為 1 個酶活單位。

CarE 酶活(U/10⁴ cell)= (△A 測定管-△A 空白管) ×V 反總×（V 樣總÷V 樣）÷細(xì)胞密度（10⁴ cell/mL）÷T

= 67×(△A 測定管-△A 空白管)÷細(xì)胞密度（10⁴ cell/mL）

V 總：上清液總體積， 1 mL；V 樣：加入上清液體積(mL) ，0.005 mL；V 反總： 1.005mL  ； T：反應(yīng)時間（min）， 3min。

3、液體中 CarE 活性

單位的定義：每毫升樣品在 37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加 1 定義為 1 個酶活單位。

CarE 酶活(U/mL )= (△A 測定管-△A 空白管) ×V 反總÷V 樣÷T 

= 67×(△A 測定管-△A 空白管)

V 樣總：上清液總體積 ，1 mL；V 樣：加入上清液體積(mL)，0.005 mL；V 反總：1.005mL； T：反應(yīng)時間（min）， 3min。