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細胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量檢測試劑盒

主要用途

GENMED細胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過酪氨酸酶反應(yīng)系統(tǒng)中底物酪氨酸氧化后，產(chǎn)生棕紅色多巴色素，呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解懸液樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種人體和動物細胞，尤其是黑色素細胞和黑色素瘤細胞裂解懸液樣品中酪氨酸酶的活性檢測，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

酪氨酸酶（tyrosinase；EC1.14.18.1）是一種單酚單加氧酶（monophenol monooxygenase），又稱為單酚酶（monophenolase）或單酚 二羥基苯丙氨酸：O2 氧化還原酶（monophenol dihydroxyphenylalanin：O2 oxidoreductase），具有雙功能的含銅糖蛋白，廣泛存在于植物、酵母和動物組織中，其蛋白結(jié)構(gòu)、大小、糖基化方式、激活特征等都不同。人體酪氨酸酶是一個跨膜蛋白，而催化結(jié)構(gòu)域在黑色素細胞（melanocyte）或色素細胞的黑色素器（melanosome）里。酪氨酸酶通過催化L-酪氨酸（L-tyrosine）等的o-羥基化（o-hydroxylation）反應(yīng)變成L-多巴（L-dopamine），進而氧化產(chǎn)生黑色素底物多巴醌（dopaquinone），從而由多巴色素（dopachrome）轉(zhuǎn)化為黑色素（melanin）中的真黑素（eumelanin），以及其它色素，包括毛發(fā)和眼睛色素。紫外線可以激活酪氨酸酶活性，嚴重時，會引起色素沉著（hyperpigmentation）。酪氨酸酶基因突變將導(dǎo)致I型眼皮膚白化?。?/span>oculocutaneous albinism）。酪氨酸酶抑制劑成為增白化妝品的重要元素?；诘孜锢野彼?，在酪氨酸酶的催化下，產(chǎn)生棕紅色多巴色素，通過其吸光值的變化（475nm波長），來定量測定酪氨酸酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

GENMED清理液（Reagent A） 毫升

GENMED裂解液（Reagent B） 毫升

GENMED緩沖液（Reagent C） 毫升

GENMED底物液（Reagent D） 毫升

GENMED陰性液（Reagent E）   微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存GENMED裂解液（Reagent B）和GENMED底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；GENMED底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

氧氣袋或氧氣鋼瓶：用于樣品反應(yīng)

微型臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。GENMED底物液（Reagent D）避免光照。然后進行下列操作。

一、 樣品準備 

1． 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2． 小心加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升GENMED裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準備

1. 準備好上述待測樣品，置于冰槽里

2. 設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長475nm 

3. GENMED緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升GENMED底物液（Reagent D）

3． 針頭法充入氧氣2分鐘

4． 加入xx微升GENMED陰性液（Reagent E）

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻

6． 室溫下（25℃）孵育60分鐘

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景讀數(shù)

四、 樣品測定

1. 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿 

2. 加入xx微升GENMED底物液（Reagent D）

3. 針頭法充入氧氣2分鐘

4. 加入50微升待測樣品（注意：50微克蛋白總量）

5. 上下傾倒數(shù)次，混勻

6. 室溫下（25℃）孵育60分鐘

7. 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)

五、 計算樣品活性

六、 酶標儀測定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品

2． 分別移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到所有孔里

3． 分別加入xx微升GENMED底物液（Reagent D）

4． 針頭法充入氧氣2分鐘

5． 分別加入xx微升GENMED陰性液（Reagent E）或待測樣品（50微克蛋白總量）

6． 輕輕搖動96孔板

7． 室溫下（25℃）孵育60分鐘

8． 即刻放進酶標儀檢測，獲得背景和樣品讀數(shù)

9． 活性計算

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 測定值由低到高變化；測定持續(xù)60分鐘；如果酶活過低，可以在37℃溫度下孵育2小時

5． 比色測定后，比色皿須清洗徹底

6． 樣本讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性

7． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供 GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

8． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

9． 可以使用酪氨酸酶抑制劑曲酸（Kojic acid）作為抑制劑對照或陰性對照

10． 酪氨酸酶單位活性定義為：在25℃，pH 6.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化產(chǎn)生1 微摩爾多巴色素所需的酶量作為一個活性單位

11． 本公司提供系列酪氨酸酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

使用承諾

杰美基因秉著“信譽至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負責更換產(chǎn)品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

訂購信息

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編號 名稱 規(guī)格

GMS70112.1 GENMED細胞酪氨酸酶活性比色法定量檢測試劑盒 20次

GMS70112.1A GENMED清理液（Reagent A）     毫升

GMS70112.1B GENMED裂解液（Reagent B）      毫升

GMS70112.1C GENMED緩沖液（Reagent C）     毫升

GMS70112.1D  GENMED底物液（Reagent D）      毫升

GMS70112.1E  GENMED陰性液（Reagent E） 毫升

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