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一氧化氮（NO）含量檢測試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-306

正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體 6mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 12mL×1 瓶，4℃避光保存。

產(chǎn)品說明：

NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中， 特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號傳遞的作用，是一種新型的生物信使分子，在機(jī)體的生理、病理過程中起著重要的作用。

NO 在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成 NO2- ，在酸性條件下，NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以計(jì)算NO 含量。為了排除樣品色素等的影響，每個樣品需做對照管。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣品處理

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間 3min）； 然后12000rpm，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測。

3、體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測定

二、測定步驟和操作表

混勻，室溫靜置 15min，以對照管調(diào)零，1mL玻璃比色皿，測定 A 550。

三、NO 含量計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.016x -0.0103，R2 = 0.9986

1、組織樣品：

NO含量定義：25℃時(shí)，每克樣品或每毫克蛋白15min 生成 1μmoL NO₂-，相當(dāng)于1μmoL NO。

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

NO 含量（μmoL/g ）=（A₅₅₀ +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W ）×10 -³

= 0.14×（A₅₅₀ +0.0103）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

NO 含量（μmoL/mg prot）=（A₅₅₀ +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣×Cpr ）×10 -³

= 0.14×（A₅₅₀ +0.0103）÷Cpr

2、其他樣品：

NO 含量定義：25℃時(shí)，每升樣品 15min 生成 1μmoL NO₂-，相當(dāng)于1μmoL NO。

NO 含量（μmoL/L ）=（A₅₅₀ +0.0103）÷0.016×V 反總÷V樣

= 140×（A₅₅₀ +0.0103）

V 反總：反應(yīng)總體積，0.9mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.4mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

注意事項(xiàng)：

1、試劑盒 2-8℃保存。

2、盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測，試劑三有腐蝕性，操作時(shí)請做好防護(hù)措施。

3、若檢測出得 OD 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍外，請將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s或稀釋，并在計(jì)算公式中除以濃縮倍數(shù)或者乘以稀釋倍數(shù)。