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Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶活性測定說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-298

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細(xì)胞中，可催化 ATP 水解生成 ADP 和無機(jī)磷。

測定原理：

根據(jù) Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶分解 ATP 生成 ADP 及無機(jī)磷，通過測定無機(jī)磷的量來確定 ATP 酶活性高低。

需自備的儀器及用品:

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制：

提取液： 液體 50mL ×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體  10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 5ml×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×3  支，-20℃保存。用時每支加 1mL 蒸餾水，現(xiàn)用現(xiàn)配；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入 3mL 蒸餾水， 4℃保存。

試劑七：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周。 

試劑八：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周。 

試劑九：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。

試劑十：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL  標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑十 20 倍稀釋，即取 0.1mL 試劑十加 1.9mL 蒸餾水 充分混勻。

定磷劑的配制： 按 H2O:  試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺 黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

樣品酶液的制備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

操作步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)（在 EP 管中加入下列試劑）

混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴 10min

混勻，8000g，25℃離心 10min，取上清液

3 定磷（1.5mLEP 管中依次加入下列試劑）

            混勻，室溫放置 30 min，在  660nm 處比色。

注意事項：

1、由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒 50 管只能測 24 份 Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格無磷。避免磷污染是檢測成敗的關(guān)鍵。

3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

計算方式：

1、血清（漿）Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATPase 活力的計算:

定義：規(guī)定每小時每毫升血清（漿） 中 Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶活力(μmol /h/ mL）=[ C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn) 管-A 空白管）÷V 樣÷T

=7.5×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATPase 活力的計算：

（1）按蛋白濃度計算：

定義：每小時每毫克組織蛋白中 Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶活力(μmol/h/mg)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷（V 樣×Cpr）÷T

=7.5×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

定義：每小時每克組織中 Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶活力(μmol/h/g)=  [C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T

=7.5×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

定義：規(guī)定每小時每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞中 Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺ -ATP酶活力(μmol/h /10⁴ ）=  [C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管 -A 空白管）÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.015×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.5mL；V 樣：加入樣本體 積，0.2mL  ；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；T： 反應(yīng)時間， 1/6 小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì) 濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g； 500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。