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脫氫抗壞血酸（DHA）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-274

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

AsA 作為植物細(xì)胞一個(gè)重要生理指標(biāo)，其 AsA  的含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA  比率)及其 合成與代謝相關(guān)酶類活性的變化涉及植物對(duì)一系列環(huán)境脅迫的響應(yīng)。DHA 是 AsA 的可逆的 氧化型，在生物體內(nèi)，與抗壞血酸共同組成氧化還原系統(tǒng)，具有電子受體的作用。

測(cè)定原理：

DTT 還原 DHA 生成 AsA ，通過(guò)測(cè)定體系中 AsA 的生成速率，即可計(jì)算出DHA 含量。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 50 mL×1 瓶，室溫保存。

試劑二：液體 40 mL×1 瓶，室溫保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入 10mL 蒸餾水充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 瓶， 4℃保存。臨用前加入 5.743 mL 蒸餾水充分溶解；吸取 0. 1 mL 上述 溶液，加入 0.9 mL 蒸餾水，混勻，即為 100μmol/L DHA。

樣品中DHA 提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織， 加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。12000g ，4℃離心 20min ，取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建議

500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔7 秒， 總時(shí)間 3min）； 12000g ，4℃離心 10min ，取上清液置于冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

DHA 測(cè)定操作：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min ，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 265 nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3、 標(biāo)準(zhǔn)管：依次在 1mL 石英比色皿加入 100μL 標(biāo)準(zhǔn)液、800μL 預(yù)熱的試劑二和 100μL 試劑三，迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 10s 和 130s 的吸光值 A1 和 A2 ，△A 空白管=A2-A1。4、 測(cè)定管：依次在 1mL 石英比色皿加入 100μL 上清液、800μL 預(yù)熱的試劑二和 100μL 試劑三，迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 10s 和 130s 的吸光值 A3 和 A4 ，△A 測(cè)定管=A4-A3。

注意：標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。 

計(jì)算公式：

1、按蛋白濃度計(jì)算

DHA(nmol/mg prot) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷ △A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷（Cpr×V 樣） 

= 100×△A 測(cè)定管÷ △A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷ △A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V 樣÷V 樣總)

= 100×△A 測(cè)定管÷ △A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷ △A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V 樣÷V 樣總) 

= 100×△A 測(cè)定管÷ △A 標(biāo)準(zhǔn)管÷細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

DHA(nmol/mL) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷ △A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷V 樣 

= 100×△A 測(cè)定管÷ △A 標(biāo)準(zhǔn)管

C 標(biāo)準(zhǔn)液：100μmol/L；V 標(biāo)準(zhǔn)：加入反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)液體積，0. 1mL；V 樣總：上清液總體 積，1.0 mL=0.001 L；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0. 1mL；W：樣品質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

1、臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內(nèi)使用完。

2、最低檢出限為 10μmol/L。