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單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-278

測(cè)定意義：

MDHAR 催化 MDHA 還原生成 AsA ，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

測(cè)定原理：

MDHAR  催化 NADH  還原 MDHA  生成 AsA 和 NAD+ ，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰， 但是 NAD+沒(méi)有。通過(guò)測(cè)定 340 nm 光吸收下降速率，來(lái)計(jì)算出MDHAR 活性。

實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍和雙蒸水 試

劑組成和配置：

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 50mL×1 瓶，室溫保存。

試劑三：粉劑×1瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。

試劑五：液體 25 μL×1 瓶，4℃保存。臨用前加 5mL 試劑二充分溶解。

粗酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱(chēng)取約 0. 1g 組織， 加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g ，4℃離心 10min ，取上清置冰上待測(cè)。

2、 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建 議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w ，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；8000g  ，4℃離心 20min ，取上清液置冰上混勻待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

MDHAR 測(cè)定操作：

1.  分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min ，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm ，蒸餾水調(diào)零。

2.  試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3.  依次在比色皿中加入 100μL 試劑三、100μL 試劑四、100μL 試劑五和 600μL 試劑二，最 后加入 100μL 上清液，迅速混勻后于 340nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2 ， △A=A1-A2。

MDHAR 活性計(jì)算公式：

1、按蛋白濃度計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH  為 1 個(gè)酶活單位。 

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（Cpr×V 樣）÷T= 804×△A ÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH  為 1U 。 

MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T= 804×△A ÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADH  為 1 個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T = 804×△A ÷  細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH  為 1 個(gè)酶活單位。 

MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷V 樣）÷T= 804×△A

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1mL=0.001 L ，V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0. 1mL；Cpr：上清液蛋白濃度， mg/mL ，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒；V 樣總：加 入提取液體積，1mL；W ，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

注意事項(xiàng)：

臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內(nèi)使用完。