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貨號：LE-1-342

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

ME 廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高 。ME 催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和 CO₂ ，以及伴隨 NAD(P)⁺ 的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME 活性與 生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物 ME  活性測定較多， 已經(jīng)成為抗氧化研究的熱。根據(jù)輔酶專一性和對底物特異性的不同，可將 ME 分為 NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測定原理：

NAD-ME 催化 NAD⁺ 還原成 NADH ，在 340nm 下測定 NADH 增加速率。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1 mL 石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存。；

試劑一：液體 40mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1支，4℃保存；用時加 2mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1支， -20℃保存；用時加 1mL 蒸餾水充分溶解備用； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液 體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰 浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一、二、三和四置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上 。如果一次性測定 樣本較多，可將試劑一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物 種）水浴 10min 以上（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，混勻，立即記錄  340 nm 波長下初始吸光度 A1 和反應(yīng) 1min 后 的吸光度 A2，計算 ΔA=A2-A1。

注意：如果 ΔA＜0.005，可將反應(yīng)時間延長到 2 分鐘或 5 分鐘。

NAD-ME 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（ nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

= 4823×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（ nmol/min/g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

= 4823×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-ME（ nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=9.646×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL；T：反應(yīng)時間， 1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)  濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。