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纖維素酶/羧甲基纖維素酶活性測定試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-102

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

CL（EC 3.2.1.4 ）存在于細(xì)菌、真菌和動物體內(nèi)，能夠催化纖維素降解，是一類可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、棉紡、環(huán)保及可再生資源利用等領(lǐng)域的酶制劑。

測定原理：

采用蒽酮比色法測定CL催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、濃硫酸和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 40mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；  臨用前加入 5mL 蒸餾水和 45mL 濃硫酸充分溶解待用。

樣品測定的準(zhǔn)備：

1 、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2 、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3 、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 620nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

37℃振蕩反應(yīng) 1h 后 ，90℃水浴 15min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后 8000g 25℃離心 10min，取上清，得糖化液

混勻 ， 90℃水浴 10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻 ，620nm 處蒸餾水調(diào)零，測定吸光值 A，計(jì)算 ΔA=A 測定管-A 對照管 。每個(gè)測定管設(shè)一個(gè)對照管。

CL 活力計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y = 5.018x - 0.0462；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y 為吸光值。

2、血清（漿）CL 活力的計(jì)算

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1μg  葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷V 樣÷T

=39.8×(ΔA+0.0462)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中CL 活力的計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg  葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 μg  葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T 

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 μg  葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T 

=0.0796×(ΔA+0.0462)

1000： 1mg/mL=1000ug/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.2mL； V 樣：加入樣本體積，0.1  mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g； 500 ：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。