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碳酸酐酶（CA）試劑盒說(shuō)明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-377

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase ，CA)是一種含鋅金屬酶，迄今在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)至少有  11種同工酶，它們的結(jié)構(gòu)、分布、性質(zhì)各異， 多與各種上皮細(xì)胞泌H-和碳酸氫鹽有關(guān)，通  過(guò)催化CO2水化反應(yīng)及某些脂、醛類水化反應(yīng)，參與多種離子交換 ，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。 

測(cè)定原理：

碳酸酐酶具有酯酶活性， 可催化乙酸對(duì)硝基苯酯反應(yīng)生成對(duì)硝基苯酚， 通過(guò)檢測(cè) 405nm 處 吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 40mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存；臨用前加入 12mL 試劑三， 充分溶解待用， 用不完的 試劑繼續(xù)-20℃避光保存。

試劑三：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）： 提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù) 30 次） ；8000g ，4℃離心 10min，取上清， 置冰上待測(cè)。

2、組織的處理： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液） ，冰浴中勻漿。 8000g  ，4℃離心 10min，取上清， 置冰上待測(cè)。 

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 405nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一、試劑二提前 25℃預(yù)熱 10min。

3、取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 100μL 樣本上清，700μL 試劑一，最后加入 200μL 試劑二。立刻混勻，測(cè)定 405nm 下 3min 處吸光值 A1  與 6min 處吸光值 A2 ，ΔA=A2-A1

CA 活力計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 2.0848x + 0.001，R² = 0.9994；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL）， y 為吸光值。

1、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 對(duì)硝基酚定義為一個(gè)酶活力單位。 

CA 活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.001) ÷2.0848×V 樣÷(V 樣×Cpr)÷T×1000

=159.89×(ΔA-0.001) ÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol  對(duì)硝基酚定義為一個(gè)酶活力單位。 

CA 活性(nmol/min/g  鮮重)=(ΔA-0.001) ÷2.0848×V 樣÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000

=159.89×(ΔA-0.001) ÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol  對(duì)硝基酚定義為一個(gè)酶活力單位。

CA 活性(nmol/min/10⁴ cell)=(ΔA-0.001) ÷2.0848×V 樣÷(500 ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000 

=0.319×(ΔA-0.001)

V 樣：加入樣本體積： 0.1mL；V 樣總：加入提取液體積， 1  mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度， mg/mL；W：樣本質(zhì)量， g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)， 500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，3min；1000，μmol 到 nmol 的換算系數(shù)。