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貨號：LE-1-197

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

蛋白質(zhì)含有三種含硫氨基酸：甲硫氨酸 、胱氨酸和 Cys 。其中，Cys 是唯一一種含有巰基的含硫氨基  酸 ，從甲硫氨酸轉(zhuǎn)化而來，并且可與胱氨酸互相轉(zhuǎn)化 。Cys 參與蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，經(jīng)常是蛋白質(zhì)活性 中心的組成部分，還可以為其它生理生化反應(yīng)提供巰基 。此外，Cys 大量積聚在皮膚和粘膜表面，在角蛋 白生成中維持重要的巰基酶的活性，并且補充巰基，以維持皮膚的正常代謝，調(diào)節(jié)表皮最下層的色素細胞 生成的底層黑色素 。具有美白 、解毒 、改善炎癥和過敏性皮膚等作用。

測定原理：

Cys 還原磷鎢酸生成鎢藍，在 600nm 處有吸收峰；通過 600nm 吸光度，計算Cys 含量。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前 1 天 ， 向試劑三中加 5 ml 蒸餾水充分溶解，再加 85％磷酸 1.25ml，混勻后蓋緊（防止水 分散失）沸水浴 2h；冷卻后加 20 ml 蒸餾水，4℃可保存 2 周。

標準品：粉劑×1 瓶，1μmol/mL 標準液，4℃保存。臨用前加 10 ml 蒸餾水，充分溶解 。1μmol/ml 標準液，4℃避光保存。用不完的試劑 4℃可保存 3 天。

自備儀器和用品：

可見分光光度計 、低溫離心機 、可調(diào)式移液槍 、 1ml 玻璃比色皿 、85％磷酸和蒸餾水。

半胱氨酸提?。?/span>

1、液體樣品中半胱氨酸提取：取 0. 1ml 液體樣品，加試劑一 0.9ml，充分混勻，8000g 4℃離心 10min，取上清液，待測。

2、組織中半胱氨酸提?。?/span>按照組織質(zhì)量（g） ：試劑一體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 試劑一）進行冰浴勻漿，8000g 4℃離心 10 min，取上清液待測。

3、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）： 試劑一體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 試劑一），超聲波破碎細菌或  細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定操作：

1、分光光度計預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 600 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、空白管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 100 μl 蒸餾水，500μl 試劑二，500μl 試劑三，混勻后室溫靜置 15 min，于 600nm 處測定吸光值，記為 A 空白管。

3、標準管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 100 μl 標準液，500μl 試劑二，500μl 試劑三，混勻后室溫靜置 15 min，于 600nm 處測定吸光值，記為 A 標準管。

4、測定管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 100 μl 上清液，500μl 試劑二，500μl 試劑三，混勻后室溫靜置 15 min，于 600nm 處測定吸光值，記為 A 測定管。

注意 ：空白管和標準管只需要做一次。 

計算公式：

1、按液體樣品的體積計算：

半胱氨酸含量 ( μmol/ml）=[C 標準品×V 標準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×（V 樣總÷V 樣）

= 1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)

2、按樣本質(zhì)量計算：

半胱氨酸含量 ( μmol/g 鮮重）=[C 標準品×V 標準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×（V 樣總÷V 樣）÷W

= 1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管) ÷W

3、按照蛋白濃度計算：

半胱氨酸含量 (μmol /mg prot）= [C 標準品×V 標準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]÷（V 樣×Cpr）

= 1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管) ÷Cpr

4、按細胞數(shù)量計算：

半胱氨酸含量 ( μmol /10⁴ cell）=[C 標準品×V 標準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)] ×（V 樣總÷V 樣×細胞數(shù)量）

= 1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管) ÷細胞數(shù)量

C 標準品：標準品濃度，1μmol/ml；V 標準品：反應(yīng)體系中加入標準品體積，0.1 ml；V 樣：反應(yīng)體系  中加入樣品提取液體積，0.1 ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml。W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度， mg/ml。

注意事項：

最低檢出限為 100μmol/L。