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纖維素含量試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-100

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，通常與半纖維素 、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起，是植物細胞壁的 主要結(jié)構(gòu)成分 。纖維素是一種重要的膳食纖維，是自然界中分布最廣 、含量最多的一種多糖。

測定原理：

纖維素為β-葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱能分解成β-葡萄糖 。β-葡萄糖在強酸作用  下 ，可脫水生成β-糠醛類化合物 。β-糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合，生成糠醛衍生物 。顏色的深淺可間 接定量測定纖維素含量。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體50ml×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存；

試劑三：液體10ml×1 瓶，4℃保存；

自備儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋、可調(diào)式移液器 、1ml 玻璃比色皿、80％乙醇、丙酮、濃硫酸（不允許快遞）、 研缽和蒸餾水。

樣品的前處理：

1、細胞壁的提?。?/span>

取約 0.3g 樣本，加入 1ml 80％乙醇，室溫快速勻漿，90℃水浴 20min（加熱過程中 EP  管可能爆開，建議用膠帶封口或使用防爆 EP 管） ，冷卻至室溫，6000g 25℃離心 10min，棄上清 。沉 淀加入 1.5ml80％乙醇和丙酮各洗一遍（渦旋振蕩 2min 左右，6000g 25℃離心 10min，棄上清即可）， 沉淀即為粗細胞壁，加入 1ml 試劑一（去除淀粉）浸泡 15 小時，6000g 25℃離心 10min，棄上清，將  沉淀干燥，稱重得細胞壁物質(zhì)（ CWM）。

2、纖維素的提?。?/span>

稱取烘干的 CWM 約  5mg，加入 0.5ml 蒸餾水充分勻漿(若烘干物質(zhì)質(zhì)地堅硬，可先研 碎后再加入 0.5ml 蒸餾水勻漿，或者用勻漿器勻漿)，勻漿液轉(zhuǎn)移至 EP 管中，用蒸餾水定容至 0.5ml， 置于冰水浴中，緩慢加入 0.75ml 濃硫酸，混勻，冰水浴中靜置 30min 。8000g 4℃離心 10min，取上清 液 ，用蒸餾水稀釋 20 倍后待測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 620nm，蒸餾水調(diào)零。

2、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。

3、工作液的配制：在試劑二中加入 4ml 試劑三，充分溶解，如較難溶解，可加熱攪拌；用不完的試劑 4℃ 保存一周；

4、加樣表（在 EP 管中反應(yīng)）：

混勻，置 95 度水浴中 10min（蓋緊， 以防止水分散失） ，冷卻至室溫后，于 620nm 處 ，分別讀取空白管和測定管吸光值，ΔA=A 測定管-A 空白管。

注意：

1、空白管只要做一管。

2、由于濃硫酸具有強腐蝕性，請謹慎操作。

纖維素含量計算：

1、標準條件下測定的回歸方程為 y = 7.875x - 0.0043；x 為標準品濃度（mg/ml） ，y為吸光值按2、樣本質(zhì)量計算：

纖維素（mg /g 干重）= [(ΔA＋0.0043) ÷7.875×V1]÷（W×V1÷V2）×20

=3. 17×(ΔA＋0.0043) ÷W。

V1：加入樣本體積，0.3ml；V2：加入提取液體積， 1.25ml；W：樣本干重，約 5×10-3g；20：樣本稀釋倍 數(shù)。

注意 ：最低檢測限為 1mg/g 干重或 10ng/ mg prot