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正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

GOT（ 2.6.1.1 ）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化可逆轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，是 氨基酸代謝的重要酶。此外，GOT 在心肌細(xì)胞中含量最高，臨床上一般常作為心肌梗塞和 心肌炎的輔助檢查。肝臟損害時(shí)其血清濃度也可升高。

測定原理

GOT 催化 α-同戊二酸和天門冬氨酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成谷氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸進(jìn) 一步自行脫羧生成丙酮酸；丙酮酸可與 2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成 2,4-二硝基苯腙，在堿性條 件下顯棕紅色；測定 505nm 吸光度的變化，即可計(jì)算 GOT 酶活力。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液：液體 30mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 5mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二：液體 6mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑三：液體 60 mL×1 瓶，4℃保存；

樣品測定的準(zhǔn)備

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定操作表

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 505nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、在 EP 管中加入下列試劑

混勻后，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng) 20min

混勻后，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴 20min

混勻，室溫放置 10min ，在 505nm 波長處，測各管吸光度 A 。 ΔA=A 測定-A 對照。每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對照管。

備注：血清(漿)等樣本煮沸過程中可能出現(xiàn)果凍狀沉淀，可取消煮沸步驟，直接加入未煮沸 的 10μL 樣本。

計(jì)算方式

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸曲線，y = 0.4768x-0.0013(x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，umol/mL；y 為 Δ A)。

2、血清（漿）GOT 活力的計(jì)算

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GOT（nmol/min/mL）= (ΔA+0.0013）÷0.4768÷T×10³

= 104.9×(ΔA+0.0013）

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中GOT 活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GOT（nmol/min/mg prot）=[(ΔA+0.0013）÷0.4786×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ 

= 104.9×(ΔA+0.0013）÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GOT（nmol/min/g 鮮重）=[(ΔA+0.0013）÷0.4768×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³

= 104.9×(ΔA+0.0013）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GOT（ nmol/min/10⁴ cell） =[(ΔA+0.0013 ） ÷0.4768×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×10³

=0.21×(ΔA+0.0013）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，20min； Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬；103：1umol/mL= 10³ nmol/mL。

注意事項(xiàng)：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：0.01 umol/mL -2 umol/mL。

2、ΔA 線性范圍為：0.01 -2。