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貨號(hào)：LE-1-339

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物 、植物 、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NAD⁺ 是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要?dú)涫荏w，生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成 ATP 的同時(shí)，形成大量的ROS， 同時(shí) NADH  再生為 NAD⁺  。糖 、脂 、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成 。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱 。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD⁺ 比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài) 。此外，NADH/NAD⁺ 比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循環(huán) 。另外，NAD+降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo) 、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

測(cè)定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD⁺ 和NADH，NADH 通過 PMS 的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲瓚，在 570nm 下檢測(cè)吸光值；而 NAD⁺ 可被乙醇脫氫酶還原為 NADH，進(jìn)一步采用 MTT 還原法檢測(cè)。

產(chǎn)品內(nèi)容：

酸性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

堿性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 14mL×1  瓶，4℃保存；

試劑二：液體 4mL×1 支，4℃保存

試劑三：粉劑×1  瓶 ，-20 ℃保存，用時(shí)加入 4ml 蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周； 

試劑四：粉劑×1  瓶 ，4 ℃保存，用時(shí)加入 4ml 蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周；

試劑五：液體 1.8mL×1 支，4 ℃保存；

試劑六：液體 30mL×1 瓶，4 ℃保存；

試劑七：液體 50mL×1 瓶，4 ℃保存；

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì) 、 臺(tái)式離心機(jī) 、移液器 、 1 ml  玻璃比色皿 、研缽 、冰和蒸餾水。

NAD⁺ 和 NADH 的提取 ：

1、血清（漿） 中 NAD⁺ 和 NADH 的提取

NAD⁺ 的提取：按照血清（漿）體積（ml） ：酸性提取液體積（ml） 為  1 ：5~ 10  的比例（建議取約 0.1ml 血清（漿），加入 1ml 酸性提取液） ，95℃水浴  5min（蓋緊， 以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心  10min；取  500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和 ，混勻，10000g 4 ℃離心  10min，取上清，置冰上待測(cè)。

NADH 的提取：按照血清（漿）體積（ml） ：堿性提取液體積（ml） 為  1 ：5~ 10  的比例（建議取約 0. 1ml  血清（漿） ，加入 1ml  堿性提取液） ，95℃水浴  5min（蓋緊， 以防止水分散失）；

冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取  500μl  上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和 ，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織中 NAD⁺ 和 NADH 的提取：

NAD⁺ 的提?。?/span>按照組織質(zhì)量（g） ：酸性提取液體積（ml） 為  1 ：5~ 10  的比例（建議取約  0. 1g 織，加入 1ml 酸性提取液） ，冰浴研磨，95℃水浴  5min（蓋緊， 以防止水分散失） ；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取  500μl  上清液，加入  500μl  堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃ 離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

NADH 的提取：按照組織質(zhì)量（g） ：堿性提取液體積（ml） 為 1 ：5~ 10 的比例（建議取約  0. 1g組織，加入 1ml 堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴  5min（蓋緊， 以防止水分散失） ；冰浴 中冷卻后，10000g 4 ℃離心  10min；取  500μl  上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻， 10000g 4 ℃離心  10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD⁺ 和 NADH 的提取：

NAD⁺ 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴ 個(gè)） ：酸性提取液體積（ml）為 500~ 1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 酸性提取液）， 超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲  3s， 間隔 10s，重復(fù) 30 次） ，95℃水浴  5min（蓋緊， 以防止水分散失） ；冰浴中冷卻后， 10000g 4 ℃離心  10min；取  500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心  10min，取上清，置冰上待測(cè)。

NADH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴ 個(gè)） ：堿性提取液體積（ml）為 500~ 1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 堿性提取液）， 超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲  3s， 間隔 10s，重復(fù) 30 次） ，95℃水浴 5min （蓋緊，以防止水分散失） ；冰浴中冷卻后， 10000g 4 ℃離心  10min；取  500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表(在 1.5ml 棕色 EP 管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置 5min 后，20000g，25℃離心 5min，棄上清，沉淀中加入：

混勻，570nm 下比色，讀取對(duì)照吸光值 A1 和測(cè)定管吸光值 A2，計(jì)算△A=A2-A1。

注意事項(xiàng)

1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一 、二 、三和四按比例配成混合液。

2、對(duì)照管和測(cè)定管的測(cè)定步驟的區(qū)別：對(duì)照管加完試劑一 、二 、三 、 四和五后必須馬上加試劑六；測(cè)定管加完試劑一 、二 、三 、 四和五后必須反應(yīng) 20min  后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若 NAD⁺ 測(cè)定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH  測(cè)定中△A（A2-A1）≤0.0222， 已低于檢測(cè)限 ，可做如下調(diào)整：

（1）將測(cè)定管避光靜置時(shí)間 20min 延長(zhǎng)到  60min；

（2）在提取 階段增加取樣量 ，即取 0.2g 樣本或 0.2ml 樣本加入 1ml 提取液。

5、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，本試劑盒 50 管保證測(cè) 24 個(gè) NAD⁺ 或 NADH.。

NAD⁺ 和 NADH 含量的計(jì)算：

一、NAD⁺ 含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.295x + 0.0302，R² = 0.9978；其中 y 為△A，x 為 NAD+濃度 nmol/ml

1 、血清（漿） 中 NAD⁺ 含量計(jì)算

NAD⁺ 含量(nmol/ml）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1) ]÷(V3×V1÷V2)

=67.8×(△A -0.0302）

2 、組織 、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD⁺ 含量計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

NAD⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(V1×Cpr)

= 3.4×(△A -0.0302）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

NAD⁺ (nmol/g  鮮重）= [(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(W×V1÷V2)

= 6.8×(△A -0.0302）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NAD⁺ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(500×V1÷V2)

=0.014×(△A -0.0302）

二、NADH 含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.2808x + 0.0222，R² = 0.9976；其中 y 為△A，x 為 NADH 濃度 nmol/ml

1、血清（漿） 中 NADH 含量計(jì)算

NADH 含量(nmol/ml）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V3×V1÷V2)

= 71.2×(△A -0.0222）

2、組織 、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH  含量計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V1×Cpr)

= 3.6×(△A -0.0222）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

NADH (nmol/g  鮮重）=[(△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(W×V1÷V2)

= 7.1×(△A -0.0222）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADH (nmol/10⁴ cell）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(500×V1÷V2)

=0.014×(△A -0.0222）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05ml；V2：加入提取液體積，2ml；V3：加入血清（漿） 體積：0. 1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)， 500  萬。

注意 ：最低檢測(cè)限為 0.1nmol/ml 或 0.1nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot