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線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-302

正式實(shí)驗(yàn)前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做與測定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：5mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：0.5 mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑四：液體10mL×2 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×2 支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×2 支，-20℃保存；

產(chǎn)品說明：

線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞色素C 氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C 的氧化，并最終把電子傳遞給氧，生成水。還原型細(xì)胞色素C 在550nm 有特征光吸收，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C 生成氧化型細(xì)胞色素C，因此550nm 光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 準(zhǔn)確稱取0.1g 組織或收集500 萬細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL 試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿600g，4℃離心5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。

4、 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ（此步可選做）。

5、 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL 試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10 秒，重復(fù)30 次），用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測定。

二、測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至550nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1） 工作液的配制：臨用前取試劑四、試劑五、試劑六各一支，將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解。分批配制工作液是為了防止當(dāng)天不能測完，導(dǎo)致工作液失效。

（2） 將工作液置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑4℃可保存一周；

（3） 在1mL 玻璃比色皿中加入40μL 樣本和800μL 工作液，立即混勻，記錄550nm 處初始吸光值A(chǔ)1 和 1min 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意：若ΔA 大于0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），使A1-A2 小于0.2，可提高檢測靈敏度。

三、復(fù)合體Ⅳ活力單位的計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細(xì)胞色素C 定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1099×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細(xì)胞色素C 定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T

=222×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol 還原型細(xì)胞色素C 定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(U/10⁴ cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.444×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10^-4 L；ε：細(xì)胞色素C 摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。