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中性轉(zhuǎn)化酶試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-290

測定意義：

蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖  代謝關(guān)鍵酶之一。根據(jù)最適 pH，將高等植物 Ivr 分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI） 兩種類型。

NI 主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，負(fù)責(zé)分解細(xì)胞質(zhì)中蔗糖為果糖和葡萄糖。

測定原理：

NI 催化蔗糖分解產(chǎn)生還原糖，進(jìn)一步與3,5－二硝基水楊酸反應(yīng)，生成棕紅色氨基化合 物，在 510nm 有特征光吸收，在一定范圍內(nèi)510nm 光吸收值與還原糖生成量成正比。通過光吸收增加速率來計算 NI 活性 

自備用品：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、移液器、 1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存; 

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存;

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存； 臨用前加入 25mL 試劑一充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存；

試劑三：液體 30mL×1 瓶，4℃保存； 

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。 12000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 

測定步驟和加樣表：

混勻， 37℃準(zhǔn)確水浴 30min 后，95℃水浴 10min（蓋緊， 以防止水分散失），流水冷卻后充 分混勻（以保證濃度不變）

混勻，95℃水浴 10min（蓋緊， 以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻， 510nm 處蒸餾水 調(diào)零，記錄各管吸光值 A，如果吸光值大于 2，可以用蒸餾水稀釋后測定（計算公式中乘以 相應(yīng)稀釋倍數(shù)）， ΔA=A 測定-A 對照。

NI 活性計算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y = 0.0016x -0.001；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL）， y 為吸光值。

1、按蛋白濃度計算：

單位的定義：37℃每 mg 蛋白每分鐘產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。

NI 活性(μg /min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T

=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

2、按鮮重計算：

單位的定義：37℃每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。

NI 活性(μg /min/g  鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2)÷T

=20.8×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.2mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，30min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。