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葡萄糖氧化酶（glucose oxidase ，GOD）試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-166

正式測定前取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

GOD（EC 1.1.3.4）廣泛存在于動物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并產(chǎn)生 H2O2， 是生物體中產(chǎn)生活性氧的代謝途徑之一。

測定原理

GOD 催化產(chǎn)生 H2O2，過氧化物酶催化 H2O2 氧化 4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物， 在 500 nm有特征吸收峰 ，顏色深淺與 GOD 活性成線性關(guān)系。

試驗中所需的儀器和設(shè)備

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、 1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸 餾水

試劑的組成和配制

提取液： 液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

緩沖液： 液體 50mL×1 瓶 ，4℃保存；

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入 20mL 緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存一個月；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入 20mL 緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存一個月；

樣品測定的準備

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟

1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 500nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一和試劑二的配制：參見試劑的組成和配制。

3、煮沸樣本的準備：取 500μL 樣本至新的 EP 管中，95℃水浴 10min，冷卻至室溫后，8000g 4℃離心 10min，取上清作為對照管的煮沸樣本待測。

4、測定操作表

混勻，35'C 保溫 15min 后，于 500nm波長處讀取吸光度。 ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。

GOD 活力單位的計算

標準條件下測定回歸方程為 y = 2.8348x - 0.0169；x 為 H₂O₂ 標準品濃度(μmol/mL），y 為ΔA。

1、血清（漿）GOD 活力的計算

單位定義： 每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H₂O₂ 為一個酶活力單位。

GOD（nmol/min/mL）= (ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷V 樣÷T×1000

=58.8×(ΔA+0.0169)

2、細菌、細胞或組織 GOD 活力的計算

（1）按蛋白濃度計算

單位定義： 每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H₂O₂ 為一個酶活力單位。

GOD（nmol/min/mg prot）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(V 樣×Cpr) ×1000÷T 

=58.8×(ΔA+0.0169)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H₂O₂ 為一個酶活力單位。

GOD（nmol/min/g 鮮重）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總) ×1000÷T 

=58.8×(ΔA+0.0169)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H₂O₂ 為一個酶活力單位。

GOD（nmol/min/10⁴ cell）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)×1000÷T 

=0.118×(ΔA+0.0169)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.625mL； V 樣：加入樣本體積，0.25mL；V 樣總：加入提取  液體積 ，1 mL；T：反應(yīng)時間，15 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。