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貨號：LE-1-271

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL 基因表達受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑 、抗氧化劑 、生長因子和炎癥因子等 。GCL 活性高低對 GSH 含量和 GSH/GSSG 比值有重要影響。

測定原理：

在 ATP 和 Mg²⁺ 存在下，GCL 催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時 ATP 去磷酸化產(chǎn)生 無機磷分子，通過測定無機磷增加速率，即可計算出GCL 活性。

試劑組成和配制：

試劑一：液體70ml×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加14mL蒸餾水充分震蕩溶解。

試劑三：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前加入蒸餾水3.5mL充分震蕩溶解。

試劑四：液體16ml×1 瓶，室溫保存。

試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 30ml 蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入 1.0 ml 濃硫酸（自 備） ，邊加邊攪拌。

自備儀器和用品：

可見分光光度計 、冷凍離心機 、水浴鍋 、移液器 、 1ml 玻璃比色皿 、濃硫酸和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（ g）：試劑一體積(ml)為 1：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 試劑 一）進行冰浴勻漿 。8000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、細(xì)菌 、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴ 個）：試劑一體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加  入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃,   離心 10min，取上清置于冰上待測。

3、血清等液體：直接測定。

GCL 測定操作

1、分光光度計預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 660 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、空白管：取 1.5mlEp 管，依次加入試劑一 240 μl 、試劑二 260μl 、試劑三 60μl 和蒸餾水 120μl，混勻后 蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng) 15 min； 再加入試劑四 300μl，混勻后，25℃、8000g，離心 10 min，取上清 500μl， 加入試劑五 500μl，混勻后蓋緊，45℃水浴 10min，冷卻后測定 660 nm 處吸光值，記為 A 空白管。

3、測定管：取 1.5mlEp 管，依次加入試劑一 240 μl 、試劑二 260μl 、試劑三 60μl 和上清液 120μl，混勻后   蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng) 15 min； 再加入試劑四 300μl，混勻后，25℃、8000g，離心 10 min，取上清 500μl， 加入試劑五 500μl，混勻后蓋緊，45℃水浴 10min，冷卻后測定 660 nm 處吸光值，記為 A 測定管。

注意 ：空白管只需要測定一次。

GCL 活性計算公式：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0. 1427x，R²=0.9987

1、按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無機磷的GCL 酶活量為 1 個酶活單位。 

GCL ( μg/min /mg prot）=[（A 測定管-A 空白管）÷0. 1427×V 反總]÷(Cpr×V 樣)÷T

=3.815×（A 測定管-A 空白管）÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無機磷的 GCL 酶活量為為 1 個酶活單位。GCL ( μg/min /g 鮮重）= [（A 測定管-A 空白管）÷0. 1427×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T 

= 3.815×（A 測定管-A 空白管）÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：37℃下，每 10⁴ 個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無機磷的GCL 酶活量為 1 個酶活單位。

GCL ( μg/min /10⁴ cell）=[（A 測定管-A 空白管）÷ 0. 1427×V 反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T 

= 3.815×（A 測定管-A 空白管）÷細(xì)胞數(shù)量

4、按照液體體積計算

活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 無機磷的GCL 酶活量為 1 個酶活單位。GCL ( μg/min /ml）= [（A 測定管-A 空白管）÷ 0. 1427×V 反總]÷V 樣÷T 

= 3.815×（A 測定管-A 空白管）

0. 1427： 回歸方程系數(shù)；V 反總：反應(yīng)總體積（ml）980μl=0.980ml；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；V  樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，120μl =0. 12 ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣本質(zhì)量，g；T： 反應(yīng)時間：15min。

注意事項：

1、樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當(dāng)日測定酶活力， 以免影響其活力 。如果是勻漿液，避 免反復(fù)凍融。

2、所有試劑配制完后，除表明 4℃保存外，請于 1 天內(nèi)用完。

3、實驗過程請帶手套，試劑三中有強腐蝕性物質(zhì)，注意不要濺到皮膚上或眼睛內(nèi)。

4、測定吸光值時請于水浴后 10～40 分鐘內(nèi)測完。

5、樣本測定前先取 1-2 個樣做預(yù)實驗，如吸光值太高，應(yīng)先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，使得吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，哺乳動物組織和血液一般稀釋 3～5 倍。

6、試劑三配制過程中，可能會產(chǎn)生黑色固體，其不影響結(jié)果，注意吸取時不要將黑色固體吸入。

7、細(xì)胞中GCL 活性測定時，細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細(xì)胞中 GCL 的提取時可加試劑一（或 生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞；