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糖原含量試劑盒說明書(分光光度法) 

貨號(hào)：LE-1-103

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

糖原是由葡萄糖單位構(gòu)成的高分子多糖，是糖的主要的儲(chǔ)存形式之一，主要貯存在肝和肌肉 中作為備用能量，分別稱為肝糖原和肌糖原。肝糖原可調(diào)節(jié)血糖濃度，當(dāng)血糖升高時(shí)可在肝 臟合成糖原，血糖降低時(shí)，肝糖原則分解為葡萄糖以補(bǔ)充血糖。因此，肝糖原對(duì)維持血糖的 相對(duì)平衡十分重要。肌糖原是肌肉中糖的儲(chǔ)存形式,在劇烈運(yùn)動(dòng)消耗大量血糖時(shí) ，肌糖原不 能直接分解成血糖 ，必須先分解產(chǎn)生乳酸,隨血液循環(huán)到肝臟,通過糖異生轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃蚱?/span> 萄糖。

測定原理：

蒽酮法。利用強(qiáng)堿性提取液提取糖原 ，在強(qiáng)酸性條件下利用蒽酮顯色劑測定糖原含量。 

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL  玻璃比色皿、濃硫酸（不允許快遞）和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液： 液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一 ：0.1mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液  10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶， 4℃保存；

糖原提?。?/span>

1、細(xì)胞或細(xì)菌：收集 500~1000 萬細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；加入 0.75mL 提  取液超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復(fù) 30 次）；轉(zhuǎn)移至  10mL 試管中，95℃水浴 20min（蓋緊，防止水分散失），隔 5min 振搖試管 1 次，使充分混  勻 ；取出試管冷卻后，用蒸餾水定容到 5ml，混勻 ，8000g 25℃離心 10min，取上清液待測。 

2、組織：稱取 0.1~0.2g 樣品，加入 0.75ml 提取液充分勻漿；轉(zhuǎn)移至 10ml 試管中；95℃水  浴 20min（蓋緊，防止水分散失），隔 5min 振搖試管 1 次，使充分混勻；待組織全部溶解后， 取出試管冷卻后，用蒸餾水定容到5ml，混勻 ，8000g 25℃離心 10min，取上清液待測 。

步驟和加樣表

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 620nm，蒸餾水調(diào)零。

2、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95℃。

3、試劑二工作液的配制：在試劑二中倒入 10mL 蒸餾水，緩慢倒入 40mL 濃硫酸，充分溶 解混勻后使用；用不完的試劑 4℃保存一周；

4、加樣表（在 EP 管中反應(yīng)）：

混勻，95℃水浴 10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻，于 620nm 波長處 ， 以蒸餾水調(diào)零， 分別讀取空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管吸光度，分別記為 A1 、A2 和 A3。

注意：

1、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要測一次。

2、如果 A3-A1 大于 2，需要將樣本用蒸餾水稀釋，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

糖原含量的計(jì)算：

1、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

糖原（mg/g 鮮重）＝1.11×(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)

= 0.555×(A3-A1)÷ （A2-A1)÷W

2、按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算

糖原(mg/mg prot) ＝1.11×(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1) ÷(A2-A1) ÷(V1×Cpr)

=0.111×(A3-A1) ÷ （A2-A1) ÷Cpr

1.11 ：是此法測得葡萄糖含量換算為糖原含量的常數(shù)， 即 111ug 糖原用蒽酮試劑顯色相當(dāng)于  100ug  葡萄糖用蒽酮所試劑顯示的顏色；C  標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.1mg/mL；V1：加入反  應(yīng)體系中糖原提取液體積，0.25mL；V2 ：加入提取液體積，5mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度， mg/mL；W：樣本鮮重，g。

注意：最低檢測限為 10ng/g 鮮重或 0.1ng/ mg prot。