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β-1,3 葡聚糖酶 (β-1,3-GA）試劑盒說明書（分光光度法 ）

貨號(hào)：LE-1-111

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

β-1,3-GA(  EC 3.2.1.73)主要存在植物中，催化 β-1,3-葡萄糖苷鍵水解。在植物染病或處于其 他逆境條件下，可誘導(dǎo)細(xì)胞大量合成 β-1,3-GA，因此 β-1,3-GA 活性測(cè)定廣泛應(yīng)用于植物病 理和逆境生理研究。

測(cè)定原理：

β-1,3-GA 水解昆布多糖， 內(nèi)切 β-1,3-葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生還原末端，通過測(cè)定還原糖生成速率 來計(jì)算其酶活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、 水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入 3mL 蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑 4℃ 保存；

試劑二：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10  的比例（建議稱取約 0.1g  組織，加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。 12000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定（在 1.5mL EP 管中依次加入下列試劑）：

充分混勻，放入 37℃水浴 60 min

充分混勻，95℃水浴 5min（蓋緊，防止水分散失），流水冷卻，550nm 處記錄各管吸光值 A，如果吸光值大于 2，可以用蒸餾水稀釋后測(cè)定（計(jì)算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照 。

注意：每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

β-1,3-GA 活性計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0958x -0.0192；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y 為吸光值。

2、血清（漿）β-1,3-GA 活力的計(jì)算

β-1,3-GA(mg/h/mL)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷V1=10.438×(ΔA +0.0192) 

3 、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 β-1,3-GA 活力的計(jì)算

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

β-1,3-GA(mg/h/mg  prot)=[(ΔA +0.0192)÷0.0958 × V1]÷(V1 × Cpr)

=10.438× (ΔA +0.0192) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每小時(shí)產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

β-1,3-GA(mg/h /g  鮮重)=[(ΔA +0.0192)÷0.09585×V1]÷(W×V1÷V2)

=10.438×(ΔA +0.0192) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

β-1,3-GA(mg/h /10⁴ cell)= [( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(500×V1÷V2)

=0.0208×(ΔA+0.0192)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V2 ：加入提取液體積， 1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃 度，mg/mL；W：樣本鮮重，g； 500 ：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。