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α-葡萄糖苷酶 (α-GC）試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法 ）

貨號(hào)：LE-1-107

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動(dòng)物、植物 、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化水解芳基或烴基與糖基之間的 α-糖苷鍵生成葡萄糖，不僅與細(xì)胞壁的松弛或加固有關(guān)，而且與細(xì)胞識(shí)別和一些信號(hào)分子產(chǎn)生密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

α-GC 分解對(duì)-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸 光值升高速率來(lái)計(jì)算α-GC 活性。

試劑組成和配制：

提取液：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×2 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 10ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃ 保存。

試劑二：液體 25 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴ 個(gè)） ：提 取液體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液） ，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì) 胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復(fù) 30 次） ； 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰 上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（ g）：提取液體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱(chēng)取約 0. 1g 組織，加入 1ml 提取 液） ，進(jìn)行冰浴勻漿 。 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

充分混勻，放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min 后，立即放入 95℃水浴 5min（蓋緊， 以防止水分散失） ，流水冷卻 后充分混勻（以保證濃度不變） ，8000g，4℃,   離心 5min，取上清液

充分混勻，室溫靜置 2min 后，  400nm 處測(cè)定吸光值 A ，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管 。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

α-GC 活力計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y =0.00543x -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/ml） ，y為吸光值。

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

α-GC 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T 

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

α-GC 活力(nmol/min /g 鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T 

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

α-GC 活力(nmol/min /10⁴ cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T 

=0. 123×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0. 1ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。