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多聚半乳糖醛酸酶試劑盒說明書(分光光度法 )

貨號(hào)：LE-1-322

正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）是一種細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，可以催化果膠分子中 α-(1,4)-聚半 乳糖醛酸的裂解，參與果膠的降解，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實(shí)軟化，與果實(shí)成熟、葉和 花的脫落、病原物防御，細(xì)胞伸展發(fā)育以及木質(zhì)化有關(guān)，在植物抗病性和食品貯藏保鮮領(lǐng)域 具有較高的研究價(jià)值。

測定原理

多聚半乳糖醛酸酶水解果膠酸生成半乳糖醛酸，具有還原性醛基，與DNS 試劑反應(yīng)生成紅 棕色物質(zhì)，在 540nm 有特征吸收峰，測定540nm 處吸光值變化可計(jì)算得多聚半乳糖醛酸酶 活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、 1 mL 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

酶液提取

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。 16000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、細(xì)菌、真菌：  按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液）， 冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時(shí)間 3min）； 然后 16000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測。

3、培養(yǎng)液：直接檢測。

測定操作表

酶活性計(jì)算公式

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 3.9642x - 0.008；R²  = 0.9996；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL；y 為吸光值。

1、按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義： 在 40℃, pH6.0 條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸 為一個(gè)酶活力單位。

PG 活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義： 在 40℃, pH6.0 條件下，每克樣本每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

PG 活性（mg/h/g  鮮重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3、按液體體積計(jì)算

酶活性定義： 在 40℃, pH6.0 條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

PG 活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷V 樣÷T

=2.523×(ΔA+0.008)

4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義： 在 40℃, pH6.0 條件下，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

PG 活性（mg/h/10⁴ cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T 

= 2.523×(ΔA+0.008)÷細(xì)胞數(shù)量

V 反總：反應(yīng)總體積，0.5mL；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；Cpr：樣本蛋白濃度， mg/mL；W ，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h

注意事項(xiàng)

煮沸樣本建議將樣本在沸水中煮沸 10 分鐘，以將酶徹底滅活。