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二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）試劑盒說明（分光光度法-25管/24樣）

貨號：LE-1-243

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

二磷酸核酮糖羧化酶（EC 4. 1. 1.39）是植物光合作用中的一個關(guān)鍵酶，既控制著CO2 的固定， 同時又制約著碳素向Calvin循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流，其活性的大小直接影響著光合速率。

測定原理：

在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1 ，5-二磷酸（RuBP）與 1 分子的 CO2 結(jié)合，產(chǎn)生 2 分子的 3-磷酸甘油酸（PGA），PGA 可通過外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫 酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，并使還原型輔酶 I（NADH）氧化。因此，340nm 吸光度的 變化可計算還原型輔酶 I 氧化速率，還原型輔酶 I 氧化速率可反應Rubisco 的活性。

需自備的儀器和用品：

可見-紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰 和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：30mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 12.5mL 試劑一，充分混勻待用；用不完的試 劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 12.5mL 試劑一，充分混勻待用；用不完的試 劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入 1.25 mL 試劑一，充分溶解待用；用不完的試 劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

注意：試劑二、三、四溶解后，按需分裝-20℃保存。

粗酶液制備：

1、總Rubisco 酶提取：建議稱取約 0. 1g 樣本，加入 1mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰 浴，200W ，破碎 3s ，間歇 7s ，總時間 1min），然后 4℃ , 8000g 離心 10min ，取上清測定。 

2、②胞漿和葉綠體 Rubisco 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5～10  的比例（建議稱取約 0. 1g 樣本，加入 1mL 提取液一），冰浴勻漿后于4℃ , 200g 離心 5min， 棄沉淀，取上清在4℃ , 8000g 離心 10min ，取上清用于測定胞漿 Rubisco 酶活性，取沉淀 加 1mL 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W ，破碎 3s ，間歇 7s ，總時間 1min）， 然后 4℃ , 8000g 離心 10min ，取上清測定葉綠體中 Rubisco 酶活性。

建議測定總 Rubisco 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的 Rubisco ，則按照步驟②提取粗酶液。

注意：粗酶液制備過程中超聲破碎操作使用細胞破碎儀進行。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三 1 ：1 混合，用多少配多少；

（2） 在1mL 石英比色皿中加入 50uL 樣本、50uL 試劑四和 900uL 工作液，混勻，立即記 錄 340nm 處 20s 時吸光值 A1 和 5min20s 時的吸光值 A2 ，計算ΔA=A1-A2。

Rubisco 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 n mol NADH。

Rubisco（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷  (ε×d） ×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=643×ΔA÷Cpr

此法需要測定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，建議選購本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒。

2、按樣本鮮重計算

單位的定義：25℃中 1 g 組織 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco（nmol/min/g  鮮重）=[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T

=643×ΔA÷W

上述計算公式中各符含義：

V 反總：反應體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol /cm；d：比 色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反 應時間，5 min；W：樣本質(zhì)量，g。