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維生素 B1 含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-281

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

維生素 B1（Vitamin B1）是構(gòu)成脫羧輔酶的主要成分，參與細(xì)胞代謝中的三羧酸循環(huán)，是維 持機(jī)體正常代謝必須的水溶性維生素 ，在生物體能量代謝中有重要的作用。

測(cè)定原理

VB1 在堿性條件下還原鐵氰化鉀生成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀與 Fe³⁺ 在弱酸條件下生成普魯士藍(lán)，在 704nm有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、研缽、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、 1 mL 玻璃比色皿、蒸餾水 。

試劑組成和配制

提取液：液體 35mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 1mL×1 瓶 ，4℃保存。

試劑二： 液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體 12mL×1 瓶，4℃保存。

試劑五：液體 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

樣本處理

1、組織：將樣品磨碎，按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為  1： 5~10  的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g，加入 0.6mL 提取液）加入提取液，60℃浸提 30min，加蒸餾水 0.4mL，混勻后于 25℃, 13000g 離心 10min，取上清測(cè)定（動(dòng)物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心 20-30 分鐘）。

2、細(xì)胞： 按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）： 提取液體積（mL）為 500~1000： 1  的比例（建議  500 萬(wàn)細(xì)胞加入 0.6mL 提取液）， 冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）； 加蒸餾水 0.4mL，混勻后于 25℃,   13000g 離心 10min，取上清測(cè)定。

3、血清： 直接測(cè)定。

測(cè)定操作

計(jì)算公式

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.017x+0.0031，R² = 0.9991 ；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度：μg/mL；y 為△A（A 測(cè)定管 -A 空白管）

1、按照蛋白含量計(jì)算

VB1 含量(μg/mg prot）= (△A-0.0031）÷ 0.017÷Cpr

= 58.8×(△A-0.0031）÷ Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB1 含量(μg/g 鮮重）= (△A-0.0031）÷ 0.017÷（W÷V 樣總）

= 58.8×(△A-0.0031）÷ W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB1 含量(μg/10⁴ cell）= (△A-0.0031）÷ 0.017÷（細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）

= 58.8×(△A-0.0031）÷  細(xì)胞數(shù)量

4、按照液體體積計(jì)算

VB1 含量(μg/mL）= (△A-0.0031）÷ 0.017 

= 58.8× (△A-0.0031）

V 樣總：加入提取液體積， 1mL； Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)

1、若測(cè)定結(jié)果中吸光值超過(guò) 1，請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2、蛋白濃度較高的樣品，比如動(dòng)物組織，若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生，將樣本稀釋后再測(cè)定， 在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3、顯色完成后立即進(jìn)行測(cè)定。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為 0.1-10μg/mL。