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維生素 B6 試劑盒說明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-282

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

維生素 B6（Vitamin B6）又稱吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在體內(nèi)以磷酸酯的形式存在，是一種水溶性維生素，在細(xì)胞中參與多種蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝，對(duì)生物體具有極其重要的作用。

測定原理：

VB6 與 4-氨基安替比林在強(qiáng)氧化劑作用下生成穩(wěn)定的黃色化合物，在 390nm 有特征吸收峰。

試劑組成和配制

提取液：液體 35mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 1mL×1 瓶 ，4℃保存。

試劑二： 液體 12mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 18mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體 18mL×1 瓶，4℃避光保存。

自備儀器和用品：

天平 、研缽 、離心機(jī) 、可見分光光度計(jì) 、恒溫水浴鍋 、 1 ml 玻璃比色皿 、蒸餾水。

樣本處理：

1、組織：將樣品磨碎，按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g，加入 0.6ml 提取液）加入提取液，60℃浸提 30min，加蒸餾水 0.4ml，混勻后于 25℃,   16000rpm 離心 10min，取 上清測定（動(dòng)物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心 20-30 分鐘）。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 0.6ml  提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒 ，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；加蒸餾水 0.4ml， 混勻后于 25℃,   16000rpm 離心 10min，取上清測定。

3、血清：直接測定。

測定操作：

計(jì)算公式：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.3635x+0.0205，R² = 0.9986

1、按照蛋白含量計(jì)算

VB6 含量( μg/mg prot）= (△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反總÷（V 樣×Cpr） 

= 13.76×(△A - 0.0205）÷ Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB6 含量( μg/g）= (△A - 0.0205）÷ 0.36359 ×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總） 

= 13.76×(△A - 0.0205）÷ W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB6 含量( μg/10⁴ cell）= (△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總） 

= 13.76×(△A - 0.0205）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4、按照液體體積計(jì)算

VB6 含量( μg/ml）= (△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反總÷V 樣 

= 13.76×(△A - 0.0205）

V 反總：反應(yīng)總體積，1ml；：V 樣：加入樣本體積，0.2ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；  Cpr：蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)：

1、若測定結(jié)果中吸光值超過 1 ，請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2、蛋白濃度較高的樣品， 比如動(dòng)物組織，若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生，將樣本稀釋后再測定，在計(jì)算公式 中乘以稀釋倍數(shù)。

3、顯色完成后立即進(jìn)行測定。