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糖原磷酸化酶 b（GPb）試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-354

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase ，GP ，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代謝的關鍵酶，使糖原分子從非還原端逐個斷開 α-1 ，4-糖苷鍵移去葡萄糖基，釋放 1-磷酸葡萄糖，直至臨近糖 原分子 α-1 ，6-糖苷鍵分支點前 4 個葡萄糖基處。GP 分為有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa）和無活性的糖原磷酸化酶 b（GPb）兩種形式。GPb 在一定濃度的腺苷酸（5，-AMP）存在 下可被激活。

測定原理：

GP 催化糖原和無機磷產(chǎn)生葡萄糖殘基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和6-磷 酸葡萄糖脫氫酶進一步依次催化 NADP 還原生成 NADPH ，在 340nm 下測定 NADPH 上升 速率，即可反映 GP 活性。添加一定濃度的腺苷酸（5，-AMP）時測定 GP（GPa 和 GPb）活性，未添加腺苷酸（5，-AMP）時測定 GPa 活性，GP 活性－GPa 活性得到GPb 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、 1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 40 mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存； 

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存； 

試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）， 進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零；

2、工作液的配制： 臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用； 用不完的試劑分裝后 -20℃保存，禁止反復凍融。

3、試劑三的配制：臨用前在試劑三瓶中加入 2.5mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

4、試劑四的配制：臨用前在試劑四瓶中加入 2.5mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

5、 試劑五的配制：臨用前在試劑五管中加入 1.25mL 蒸餾水充分溶解待用 ；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

6、將工作液、試劑三、試劑四和試劑五置于 37℃預熱 5 分鐘；

7 、1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本、50μL 試劑三、50μL 試劑四、50μL 蒸餾水和 800μL 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處 5min 后的 A1 和 10min 后的吸光值 A2，計算 ΔAGPa=A2-A1。

8 、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本、50μL 試劑三、50μL 試劑四、50μL試劑五和 800μL工作液，立即混勻，記錄340nm 處 5min 后的 A3 和 10min 后的吸光值  A4，計算 ΔAGP=A4-A3。

注意： 由于每個樣本需要同時測一個 GP（GPa 和GPb）活性和一個 GPa 活性， 因此本試劑 盒 50 管測 24 個樣本。

 GPb 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

GPb （nmol/min/mg  prot）= [(ΔAGP -ΔAGPa)×V 反 總 ÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣 ×Cpr) ÷T

=643×(ΔAGP-ΔAGPa)÷Cpr

2、按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

GPb（nmol/min/g 鮮重）= [(ΔAGP-ΔAGPa)×V 反總 ÷(ε×d）×10⁹]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=643×(ΔAGP-ΔAGPa)÷W

V 反總：反應體系總體積， 1×10^-3 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。